Lignin için Maule Boyama: Arabidopsis Thaliana Kök Bölümlerinde Lignin Dağılımını Karakterize Etmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Pradhan Mitra, P. et al., Arabidopsis thaliana İkincil Hücre Duvarı Elemanlarının Histokimyasal Boyanması. J. Vis. Uzm. (2014).

Bu videoda, özel bitki hücrelerinde bulunan siringil ligninin boyanması için Maule boyama tekniğini açıklıyoruz. Bu boyama tekniği, ksilem ve interfasiküler liflerdeki lignin dağılımını karakterize etmeye yardımcı olur.

Protokol

1. Mäule Staining

1. % 0.5'lik bir potasyum permanganat çözeltisi hazırlamak için 0.2 g potasyum permanganatı 40 ml damıtılmış suda çözün. Koyu renkli bir şişede oda sıcaklığında en fazla 7 gün saklayın.
   1. 9 ml damıtılmış suya (1:10) 1 ml konsantre HCl (37 N) ekleyerek% 3.7'lik bir HCl çözeltisi hazırlayın. Deney gününde taze% 3.7 HCl çözeltisi hazırlayın. Kullanılan 37 N HCl stok çözeltisinin çok eski olmadığından emin olun. Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi (14.8 M), doymuş çözeltinin molaritesinin azalmasını önlemek için 4 °C'de saklanmalıdır.
2. Gövde bölümlerini 2.0 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bölümleri içeren tüpe 1 ml% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi ekleyin.
   1. % 0.5 potasyum permanganat çözeltisini, tercihen bölümleri rahatsız etmeden nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. 2 dakika inkübe edin ve pipetlemeyi tekrarlayın. Mikrosantrifüj tüpünü tüm bölümler yerine oturana kadar bekletin.
      not: Bölümler zarar görebileceğinden, bölümleri pipet ucuna pipetlememeye dikkat edin. Çözelti karanlık olduğu için gövde bölümlerini görmek zor olabilir, bu nedenle tüpü bölümleri test tüpü rafında tutun ve 2 dakika oturmalarına izin verin.
   2. 1 ml'lik bir pipet kullanarak 700 μl% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi çıkarın. Potasyum permanganat çözeltisini durulamak için 700 μl damıtılmış su ekleyin. 3-4 kez veya su çözeltisi berrak kalana kadar tekrarlayın.
   3. Suyu atın. Bölümlerden koyu kahverengi renk boşalana kadar hızlı bir şekilde 1 ml% 3 HCl ekleyin. Bu 3-5 dakika içinde gerçekleşebilir veya her biri 5 dakikalık 2 yıkama gerektirebilir. Tüm %3'lük HCl solüsyonunu pipetleyin ve hemen bir sonraki adıma geçin.
   4. 1 ml konsantre amonyum hidroksit çözeltisi ekleyin. Ucu bölümler zarar görmeden kolayca pipetlenebilecek şekilde kesilmiş 1 ml'lik bir pipet kullanın. Bölümleri yavaşça uca ve bir mikroskop lamına pipetleyin. Bölümleri bir lamel ile örtün. Parlak alan aydınlatması altındaki bölümleri gözlemleyin. (Şekil 1)
      Dikkat: Amonyum hidroksit son derece aşındırıcı olduğundan, mikroskop veya lens aşamasında korozyona neden olmamak için ekstra özen ve dikkat gerektirir.
      not: Amonyum hidroksit dumanları lamel buğulanarak numunenin gözlemlenmesini zorlaştırabilir. Bu nedenle, lamel eklemeden önce ekstra dikkatli olun. Solüsyon 5-10 dakika içinde kurur, bu nedenle görüntüleme bu süre içinde tamamlanmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1. A. thaliana gövde kesitlerinin Mäule boyaması. İnterfasiküler liflerin ve ksilem hücrelerinin (AE) duvarlarında normal lignin birikimini gösteren yabani tip A. thaliana gövde bölümünün mäule boyaması (kırmızı renk). Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler lifler (Fi), öz (Pi) ve ksilem (Xy) pozisyonları belirtilir. Büyütmeler: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Çubuk = 100 μm'dir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
agaroz	EMD (Türkçe)	MERC2125	CAS Numarası: 9012-36-6
hidroklorik asit	EMD (Türkçe)	HX0603-75	CAS Numarası: 7647-01-0
Vibratom	Leica Belediyesi	Leica Titreşimli bıçak mikrotom VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ Ürünler/Kesit/titreşimli bıçak-mikrotomlar/detaylar/ürün/ leica-vt1000-s/
jilet	Amerikan Güvenlik tıraş bıçağı şirketi	Ürün # 60-0139-0000	Paslanmaz Çelik Çift Kenarlı Bıçak (Personna Super)
Vidalı Kapaklı Mikrosantrifüj Tüpleri (2 ml)	VWR (VWR)	16466-044
Mikrosantrifüj Tüpleri (0.6 ml)	Axygen Bilimsel	MCT-060-C
Doku yapıştırıcısı	Ted Pella A.Ş.	10033	3 ay veya daha uzun süre saklamak için 4 °C veya 20 °C'de saklayın
Mekanik deklanşörü olmayan CCD çipli kamera	Hamamatsu	C4742-95
Kamera yazılımı	Moleküler Cihazlar	MetaMorph sürüm 7.7.0.0
Analitiği hayal etmek	kerpiç	Photoshop CS4
Mikro Kapaklı Camlar, Kare, No. 1	VWR (VWR)	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8 inç) - Kapak camları korozyona dayanıklıdır
Buzlu Mikro Slaytlar, 1 mm	VWR (VWR)	48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
Amonyum hidroksit	EMD (Türkçe)	AX1303-6	CAS Numarası: 1336-21-6
Potasyum permanganat	Sigma	223468	CAS Numarası 7722-64-7

Serisi Serisi Serisi