$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kök Gömme
- Suda% 7'lik bir agaroz çözeltisi yapın (100 ml damıtılmış suda 7 g elektroforez dereceli agaroz). Agarozu 20 dakika otoklavlayarak veya en düşük yoğunlukta 20 dakika mikrodalgada pişirerek çözün (örneğin, 1.250 watt'lık bir mikrodalga fırının %10 yoğunluğu).
- Plastik şişeler kullanarak sapları gömmek için ev yapımı bir kalıp hazırlayın.
- Bir tıraş bıçağı kullanarak, 2 ml'lik vidalı kapaklı bir mikrosantrifüj tüpünün (Bölüm A) konik tabanını kesin. Bir şırınga iğnesi ile, tüp kapağına gömülecek sapın çapından biraz daha büyük bir delik açın. Ardından, 0,6 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpünün (Bölüm B) altından 0,5 cm kesin.
- 0,6 ml'lik mikrosantrifüj tüpünün 0,5 cm'lik kesik kısmını önceden kesilmiş 2 ml'lik mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Parafilm kullanarak iki parçayı kapatın (Şekil 1).
NOT: Tüpün alt kısmı, agaroz katılaştıktan sonra gömülü numunenin çıkarılmasını kolaylaştırmak için kesilir. Kapaktaki delik, gövde agaroza gömüldüğünde gövdenin sabit tutulmasına yardımcı olacaktır. Kalıp, agarozu tutmaya ve gömme sırasında gövdeyi düz tutmaya hizmet edecektir. Parafilm, agaroz ayarlanana ve gövde gömülene kadar A ve B olmak üzere iki parçayı tutacaktır.
- Bir tıraş bıçağı kullanarak, ilgilenilen alandan bir gövde bölümü kesin (örneğin, ilk gövde ara düğümünün ortasında).
NOT: İdeal olarak, dehidrasyon yoluyla tahribatı önlemek için gövde gömmeden hemen önce kesilmelidir. Alternatif olarak, gövde geçici olarak suyla ıslatılmış bir filtre kağıdı içeren bir plakada saklanabilir. Bu plaka, doku dehidrasyonunu ve deformasyonunu önlemek için gömülmeye hazır olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir. Sapı yüksek nem olmadan 30 dakikadan daha uzun süre saklamak, sapın kurumasına neden olur.
- Agarozu mikrodalgada düşük yoğunlukta eritin.
DİKKAT: Agaroz içeren şişe sıcak olabilir. Şişeyi almak için bir eldiven kullanın. Erimiş agarozu oda sıcaklığında (20 °C ile 25 °C arasında) yaklaşık 50 °C'ye soğuyana kadar bekletin.
- Şişeyi doldurmak için 5 ml agarozu önceden hazırlanmış plastik kalıba yavaşça pipetleyin.
NOT: Kalıplarda hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları, agaroz kalıbında boşluklara neden olacak ve gövde numunesini tamamen kaplamayacaktır, bu da sonunda numune bölümlerinin eşit olmayan şekilde kesilmesine yol açacaktır.
- Agarozun yarı katı hale gelmesi için 30 ila 60 saniye soğumaya bırakın. Küçük bir kürdan ile test edin, agarozun içine nüfuz edip ayağa kalkabildiğinden, ancak yüzemediğinden emin olun.
NOT: Sap, agaroz hala sıcakken yerleştirilirse, gövdeyi buruşturarak numuneye zarar verir ve hücre morfolojisini tahrip eder.
- Sapı bu agaroz dolgulu şişeye yerleştirin. Sapın düz kaldığından emin olun. Delikli kapağı, sapın ucu kapak tarafından tutulacak şekilde yerleştirin. Vidalı kapağı çevirmeyin. Bazen birden fazla gövde (tek bir türden) tek bir şişeye gömülebilir; Ancak bu özel durumda, cap.
NOT: Vidalı kapak döndürülürse gövde bükülür.
- Şişeyi oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 10-30 dakika katılaşana kadar bırakın.
- Kalıbı yavaşça borudan dışarı kaydırarak çıkarın. Parafilm'i açın. Katılaşmış agarozu Kısım A'dan bir cam mikroskop lamı üzerine bırakmak için kalıbın B Kısmının altını baş parmağınızla hafifçe itin.
- Agaroz gömülü gövdeyi yaklaşık 1,2 cm uzunluğunda üç eşit parçaya kesin. Sapın agarozda olmayan kısmını kesin ve atın.
- Bu agaroz parçalarını, gömülü sapları ile birlikte hava geçirmez 2 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinde, bölüme hazır olana kadar karanlık bir kutuda 4 °C'de saklayın. Alternatif olarak, tüpleri en fazla bir hafta boyunca 4 °C'de saklayın.
NOT: Depolama mümkündür, ancak deneycinin gömülü gövdelerin hala canlı olduğunu ve deneye bağlı olarak artefaktların potansiyel olarak ortaya çıkabileceğini bilmesi gerekir.
2. Kök Kesit Alma
DİKKAT: Vibratom kılavuzunu dikkatlice okuyun ve tüm güvenlik talimatlarına uyun.
- Numune diskinin temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun (herhangi bir katı veya sıvı içermez). Önceki deneylerden kalan yapıştırıcıyı çıkarmak için numune diskini bir tıraş bıçağıyla temizleyin ve suyla yıkayın. Ardından bir kağıt havluyla kurulayın.
NOT: Bu, yapıştırıcının iyi çalışmasını ve agaroz örneğine bağlanmasını sağlayacaktır. Bu adım düzgün bir şekilde yapılmazsa, numunenin diske yapışmaması ve daha sonra numunenin kesit alma sırasında diskten düşmesine neden olması mümkündür.
- Numuneleri içeren agaroz bloğundaki nemi gidermek için yumuşak kağıt mendiller kullanın.
- Numune diskinin üzerine küçük bir damla doku yapıştırıcısı yerleştirin. Yapışkan şişenin ucunu kullanarak plakanın ortasındaki alanı kaplayacak şekilde yapıştırıcıyı çizin. Agaroz bloğunu, numuneler sırasıyla enine veya boyuna kesitler için plakaya dik veya plakaya paralel olacak şekilde hızlı bir şekilde yerleştirin. Yapıştırıcının numuneyi oda sıcaklığında veya 4 °C'de 10-30 dakika boyunca numune diskine sabitlemesine izin verin.
NOT: Bu, zamana duyarlı bir adımdır.
- Numune diskini tampon tepsisi veya oluk üzerindeki yerine sabitleyin. Bölümlerle agaroz blokları / blokları tıraş bıçağına paralel olmalıdır. Tampon tepsisini, numuneler tamamen suya batırılana kadar oda sıcaklığında damıtılmış suyla doldurun.
- Bir tıraş bıçağını ikiye bölün ve ardından bıçağın tamamen düz kalması için uçlarını sağlam bir makasla kesin. Önceden kesilmiş tıraş bıçağının yarısını bıçak tutucusuna takın.
- Bıçak tutucunun açısını 84°'ye, hızı 0,90 mm/sn'ye (vibratomda konum 8) ve frekansı 50 Hz'e (vibratomda konum 5) ayarlayın. 100 μm kalınlığında kesitler kesin. Sürekli modu kullan.
NOT: Bu kalınlık, dokunun bazı boyama protokollerinde kullanılan çeşitli asit ve baz işlemlerine dayanabilmesini sağlamak için seçilmiştir. Pencereyi kesit için ayarlayın ve vibratomun yaklaşık 1,2 cm'lik bir agaroz bloğunu kesit alması için sürekli modda 15-20 dakika bekleyin.
- Tampon tepsisinde bölümlere ayırma sırasında tek kullanımlık bir plastik pipet kullanarak bölümleri toplayın. Alternatif olarak, bölümler tampon tepsisinden bir cam behere ve daha sonra şeffaf bir Petri plakasına aktarılabilir. Birkaç bölümü 2.0 ml'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
NOT: Örnekler bir Petri plakasından toplanır, çünkü bölümleri net bir arka plan üzerinde görmek daha kolaydır ve tampon tepsisi bir sonraki örnek için astarlanabilir.
- Bölümler 50 ml'lik bir tüpte saklanabilir veya 1.5 ila 2 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinde 4 ° C'de 30 ila 60 dakika boyunca toplanabilir ve saklanabilir
NOT: Bölümlerin daha uzun süre saklanması görüntü kalitesinin düşmesine neden olur.
3. Calcofluor Beyaz Boyama
- % 0.2'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 0.02 g floresan parlatıcı 28 (calcofluor white M2R) 10 ml damıtılmış suda çözün. % 0.2'lik çözelti, 4 ° C'de koyu renkli bir şişede altı ay boyunca saklanabilir. % 0.2'lik stok çözeltisini 10x damıtılmış su ile seyrelterek% 0.02'lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Gövde bölümlerini 2.0 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 1 ml% 0.02 calcofluor white çözeltisi ekleyin. %0,02'lik calcofluor white solüsyonunu yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.
NOT: Bölümlere zarar verebileceğinden, bölümleri pipet ucuna pipetlememeye dikkat edin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve pipetlemeyi tekrarlayın. Bölümü oda sıcaklığında 3 dakika daha inkübe edin.
NOT: Bölümlere zarar vermeden çözeltiyi pipetlemeyi kolaylaştırmak için bölümlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
- 700 μl% 0.02 kalkoflor beyazı çözeltisi çıkarmak için 1 ml'lik bir pipet kullanın ve 700 μl damıtılmış su ekleyin; kalkoflor beyazı çözeltisini durulamak için 5 dakika bekleyin. Yıkamayı 3-4 kez tekrarlayın. Pipet ucu, bölümler zarar görmeden kolayca pipetlenebilecek şekilde kesilmiş 1 ml'lik bir pipet kullanın.
- Bölümleri yavaşça uca ve bir mikroskop lamına pipetleyin ve üzerlerini bir lamel ile örtün. UV ışığı altındaki bölümleri gözlemleyin.
