Yöntem makalesi

Anyon değişim kromatografisi bazlı protein saflaştırması: Net yüke dayalı olarak diyaliz edilmiş bakteri lizatından ilgilenilen bir proteini izole etmek için bir ayırma tekniği

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Fuehner, S., et al. İmmün Hücre Stimülasyonu için İnsan S100A12 ve İyonla İndüklenen Oligomerlerinin Saflaştırılması J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, bir Escherichia coli kültüründen alınan proteinin net yüzey yüküne dayalı olarak insan kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 saflaştırmak için bir anyon değişim kromatografisi tekniği gösteriyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protein Saflaştırma

  1. Anyon değişim kromatografisi
    1. diyaliz
      1. 20 mM Tris, 1 mM EDTA ve 1 mM etilen glikol-bis(2-aminoetileter)-N, N, N', N'-tetraasetik asidi (EGTA) deiyonize suda çözerek anyon değişim kromatografisi (AIEX) tamponu A'yı hazırlayın ve pH'ı HCl ile 8.5'e ayarlayın. Diyaliz için 2 x5 L ve kromatografi için 2x 1 L AIEX tamponu A.
        hazırlayın not: Diyalizat hacmi, numune hacminin yaklaşık 100 katı olmalıdır. Kromatografi için kullanılan tüm tamponlar filtrelenmeli (0.45 μm veya daha küçük) ve gazdan arındırılmalıdır (örn. ultrasonik banyo veya vakumlu gaz giderme ile).
      2. Dönen karıştırma çubuğunun üzerinde numune kaldırma kuvvetini sağlamak için diyaliz tüpünü (moleküler ağırlık kesme [MWCO]: 3,5 kDa) hava için ek boşlukla uygun bir uzunlukta kesin.
        not: Gliserol zarı korur ve kullanmadan önce çıkarılması gerekir.
      3. Temizlenmiş protein çözeltisinin viskozitesini azaltmak için, kromatografi kolonuna sonraki uygulamayı kolaylaştırmak için çözeltiyi 25 mL AIEX tampon A ile seyreltin. İlk kapağı boruya takın, numuneyi zarın içine yükleyin ve ikinci kapağı borunun üst ucundan en az 1 cm uzağa takın.
      4. AIEX tampon A içeren 5 L'lik kabı bir karıştırma plakasına yerleştirin, bir karıştırma çubuğu ve protein çözeltisi ile doldurulmuş zarı ekleyin. Dönen karıştırma çubuğu ile etkileşimi önleyerek numuneyi döndürmek için hızı ayarlayın. 4 ° C'de 12−24 saat diyalize edin, ardından diyalizat tamponunu (AIEX tampon A) önceden soğutulmuş taze bir preparatla değiştirin ve en az 4 saat daha devam edin. Diyalize protein solüsyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 0.45 μm'lik bir filtre ünitesinden süzün.
        not: Depolama mümkün.
    2. Kromatografi
      1. Sıvı kromatografi sistemini (FPLC) genel bakımla başlatın, AIEX A ve AIEX B kolon tamponlarını (1 M NaCl ile AIEX tampon A) ve anyon değiştirici reçine içeren kolonu bağlayın. Genel kromatografik parametreler için Tablo 1'e bakın.
        not: Tamponlar, kolon ve FPLC ekipmanı, çalışmaya başlamadan önce aynı sıcaklığa dengelenmelidir (Tablo 1, Tablo 2'deki kromatografik parametrelere bakın).
      2. Kolonu AIEX tamponu A ile dengeleyin, ardından numuneyi kolona yükleyin ve proteinleri %0 ila %100 yüksek tuz tamponu (AIEX B) arasında doğrusal bir gradyanla elüte edin. Ayrıntılı bir yöntem protokolü için Tablo 2'ye bakın.
      3. Elüsyon sırasında 2 mL fraksiyon toplayın ve Coomassie lekeli %15 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) üzerinde her fraksiyonun 10 μL'sini analiz edin. Diyaliz için S100A12 proteini içeren fraksiyonları bir araya getirin.
        not: S100A12'nin moleküler ağırlığı 10,575 Da'dır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tablo 1: Anyon değişim kromatografisinin uygulanan parametreleri hakkında ayrıntılı bilgi.

Yatak Hacmi (CV)75 mL
ekran280 nM'de absorbans
Basınç Maksimum3 çubuğu
Sütun arabelleği A20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8.5
Süt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%25 HCl  Carl Roth  X897.1
4&eksi; %20 Mini-PROTEAN TGX Protein Jelleri  BioRad  4561093
Coomassie Briliant Blue R250 Leke Giderici Solüsyon  BioRad  1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Boyama Solüsyonu  BioRad  1610436
EDTA disodyum tuzu dihidrat  Carl Roth  8043.1
EGTA  Carl Roth  3054.3
Q Sefaroz Hızlı Akış  GE Sağlık  17-0510-01  Anyon değişim kromatografisi için reçine
Sodyum klorür (NaCl)  Carl Roth  3957.2
Sodyum hidroksit  Carl Roth  P031.1
Tris Base  Carl Roth  4855.3
0.45 &mikro; M Şırınga Filtresi  Merck  SLHA033SS
5 L ölçü kabı  Carl Roth  CKN3.1
50 mL konik santrifüj tüpleri  Corning  430829
Diyaliz Tüpleri Kapakları  Spektrum  132738
Fraksiyon toplayıcı tüpleri 5 mL  Greiner  115101
Spectra/Por Diyaliz Membranı (3.5 kDa)Spektrum  132724
Steritop filtre ünitesi  Merck  SCGPT01RE
Ä KTA temizleyici UPC 10  GE Sağlık  FPLC Sistemi
Kesir toplayıcı  GE Sağlık  Frac-920
Mini Protean Tetra Hücresi  BioRad  1658000EDU
NanoFotometre  İçe Almak  P330
pH ölçüm cihazı  Süs eşyası  765

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ba lama TamponuEl syon TamponuFPLC Sistemiapraz Ba l AgarozKuaterner Amin GruplarTuz GradyanProtein Fraksiyonlar

İlgili makaleler