Kalsiyum Bağımlı Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi: Hidrofobik Etkileşimlere Dayalı Kalsiyum Bağlayıcı Proteinleri Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Fuehner, S., et al., Bağışıklık Hücresi Stimülasyonu için İnsan S100A12 ve İyon Kaynaklı Oligomerlerinin Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, kalsiyuma bağımlı hidrofobik etkileşim kromatografisi yoluyla diyalize edilmiş bir hücre lizatından kalsiyum bağlayıcı proteinin saflaştırılmasını gösteriyoruz. Kalsiyum bağlayıcı proteinler, kalsiyum ile bağlandıktan sonra hidrofobik bir bölge açığa çıkarır ve reçine üzerindeki hidrofobik bir grupla etkileşimi kolaylaştırır. Daha sonra bu proteinler, etkileşimi tersine çeviren kalsiyum şelatör EDTA kullanılarak ayrıştırılır.

Protokol

1. Kalsiyum bağımlı hidrofobik etkileşim kromatografisi (HIC)

1. diyaliz
   1. Protein çözeltisini 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5'e karşı diyalize edin
2. Kromatografi
   1. 20 mM Tris, 140 mM NaCl ve 25 mM CaCl2'yi deiyonize suda çözerek 1 L kromatografi tamponu HIC A hazırlayın ve pH'ı 7.5'e ayarlayın. HIC tamponu B için 20 mM Tris, 140 mM NaCl ve 50 mM EDTA'yı çözün. PH'ı 7.0'a ayarlayın ve tamponları filtreleyin ve gazını alın. Numuneye 25 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar CaCl2 ekleyin ve 0.45 μm'den süzün. HIC tamponlarını dengeleyin ve 4 °C'ye (sütun sıcaklığı) numune alın.
   2. Sıvı kromatografi sistemini genel bakım ile başlatın, HIC A ve B kolon tamponlarını ve kolonu bağlayın. Daha fazla kromatografik parametre için Tablo 1'e bakın.
   3. Sütunu dengeleyin, numuneyi yükleyin ve UV sinyali tekrar taban çizgisi seviyesine ulaşana kadar 'bağlanmamış numuneyi yıka' bloğunu uzatın. Daha sonra tampon (EDTA) içeren bir kalsiyum şelatörü ile elüsyona başlayın. Ayrıntılı bir yöntem protokolü için Tablo 2'ye bakın.
      not: Önceki deneyler, fazla kalsiyumun S100A12 kromatografi reçinesine bağlanması için faydalı göründüğünü göstermiştir.
   4. 2 mL'lik tepe fraksiyonlarını toplayın ve her fraksiyonun 10 μL'sini Coomassie lekeli% 15 SDS-PAGE üzerinde analiz edin. Saf S100A12 fraksiyonlarını bir araya getirin ve Hepes tamponlu saline (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) karşı diyalize
      not: Monomerik S100A12 yok olma katsayısı 2980 M-1 cm-1'dir.

Sonuçlar

Tablo 1: Hidrofobik etkileşim kromatografisinin uygulanan parametreleri hakkında ayrıntılı bilgi.

blok	hacim	arabellek	çıkış
Dengeleme	1-2 sütun hacimleri (CV'ler)	Bir	çöp
Numune yükü

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
kimyasal
EDTA disodyum tuzu dihidrat	Carl Roth'un fotoğrafı	8043.1
Fenil Sefaroz Yüksek Performans	GE Sağlık	17-1082-01	Hidrofobik etkileşim kromatografisi için reçine
Sodyum klorür (NaCl)	Carl Roth'un fotoğrafı	3957.2
Sodyum hidroksit	Carl Roth'un fotoğrafı	P031.1 Serisi
Tris Tabanı	Carl Roth'un fotoğrafı	4855.3
% 25 HCl	Carl Roth'un fotoğrafı	X897.1
Kalsiyumklorid Dihidrat	Carl Roth'un fotoğrafı	5239.1
Laboratuvar Gereçleri
0,45 μm şırınga filtresi	Merck	SLHA033SS
14 mL yuvarlak tabanlı tüpler	Bd	352059
2 L Erlenmyer şişesi	Carl Roth'un fotoğrafı	LY98.1
Fraksiyon kollektör tüpleri 5 mL	Greiner	115101
Spectra/Por Diyaliz Membranı (3.5 kDa)	tayf	132724
Steritop filtre ünitesi	Merck	SCGPT01RE
ekipman
Kesir toplayıcı	GE Sağlık	Frak-920