Nikel Afinite Kromatografisi Bazlı Protein Saflaştırması: Polihistidin Etiketli Rekombinant Proteinleri Bakteriyel Hücre Lizatından Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Pokhrel, A. et al. Clostridium difficile'den bir (p)ppGpp Sentetaz için bir Saflaştırma ve İn Vitro Aktivite Testi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, Clostridium difficile bakterilerinden histidin etiketli pirofosfokinaz enzimlerini saflaştırmak için nikel afinite kromatografisi tekniğini gösteriyoruz.

Protokol

1. Nikel Afinite Kromatografisi ile Protein Saflaştırması

1. Bir yerçekimi sütunu üzerinde 1 mL Nikel-Nitriloasetik Asit (Ni-NTA) reçinesi kullanarak proteini saflaştırın.
   1. Kullanımdan bir gün önce, kolonu gece boyunca 4 ° C'de 2 mL dengeleme tamponu (10 mM Tris-HCl pH 7.79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 0.5 mg / mL lizozim, 5 mM MgCl₂, 10 mM imidazol, 0.25 mM DTT, 5 mM fenilmetan sülfonil florür (PMSF),% 10 gliserol) ile dengeleyin.
   2. Ertesi gün, arıtılmış lizatı yüklemeden önce sütunu 4 °C'den RT'ye getirin ve ~ 2–3 h.
      bekletin not: Kolonu termal dengeye getirmek, kolon içinde hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için çok önemlidir.
   3. Peleti lizis tamponunda yeniden süspanse edin (10 mM Tris-HCl pH 7.8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄,% 10 gliserol, 0.5 mg / mL lizozim, 10 mM imidazol, 0.25 mM DTT ve 5 mM PMSF).
   4. Hücreleri 8 x 10 s aralıklarla buz üzerinde sonikate edin, darbeler arasında 30 s duraklayın.
   5. Bir mikrosantrifüj kullanarak 4 ° C'de 30 dakika boyunca 3.080 x g'da santrifüjleme yoluyla lizatı arıtın.
   6. Eşit hacimlerde lizis tamponu ile lizat hazırlayın, ardından önceden hazırlanmış arıtılmış lizatı kolona uygulayın ve akışı toplayın.
   7. Arıtılmış lizat akışını kolona yeniden uygulayın ve ikincil akışı toplayın.
   8. Kolonu yıkama tamponu 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 30 mM imidazol,% 10 gliserol) ile yıkayın. Flow-through.
      toplayın NOT: Yıkama ve elüsyon tamponlarına 5 mM_MgCl2'nin dahil edilmesi, saflaştırılmış proteinin enzimatik aktivitesi için önemlidir.
   9. Kolonu yıkama tamponu 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄ ve 50 mM imidazol) ile yıkayın.
   10. Akışı toplayın.
   11. 2 mL elüsyon tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄,% 10 gliserol ve 75 mM imidazol) uygulayın. Akışı her biri 1 mL'lik iki fraksiyonda toplayın.
       not: Bu adımdan sonraki kolon, aynı protein bir sonraki saflaştırma tahlilinde saflaştırılacaksa, 4 ° C'de dengeleme tamponunda saklanabilir. Sütun, uygun şekilde saklanırsa 3 defaya kadar kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ni-NTA reçinesi	G Biyolojik Bilimler	786-940/941
Pierce Tek Kullanımlık Yerçekimi kolonları, 10 mL	Termo Bilimsel	29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 diyaliz cihazı (MWCO: 20-kD)	tayf	G235033
Ultrasonik işlemci	Sonics	VC-750
D3024/D3024R rotorlu mikrosantrifüj	Scilogex Belediyesi