$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Mikobakterilerden toplam kovalent bağlı olmayan lipidlerin ekstraksiyonu (Şekil 1)
- Katı bir ortamdan 0,2 g mikobakteriyi kazıyın ve politetrafloroetilen (PTFE) astar vidalı kapakları olan bir cam tüpe ekleyin. 5 mL kloroform ve 10 mL metanolden oluşan bir çözelti ekleyin (kloroform: metanol, 1: 2).
not: Organik çözücüler kullanıldığında sadece cam alıcı kullanılmalıdır. Plastik kaplara izin verilmez. Ayrıca, şişeler için PTFE astar vidalı kapaklara ihtiyaç vardır.
Dikkat: Kloroform, potansiyel olarak toksik ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Metanol potansiyel olarak toksik ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
- Mikobakteriyel hücre yüzeyinden kovalent bağlı olmayan lipitleri çıkarmak için tüpü gece boyunca sürekli karıştırarak bırakın.
not: Bir orbital sallama platformu mevcut değilse, sürekli karıştırma, mümkün olduğunca sık periyodik manuel karıştırma ile değiştirilebilir.
- Bir cam huniyi bir filtre kağıdı ile örtün, organik çözücüleri filtreleyin ve bunları bir cam tüpte toplayın.
- Tüpteki sıvı fazı buharlaştırmak için bir nitrojen gazı akışı kullanın. Tüpü nitrojen gazı ile doldurun, örtün ve 4 °C.
'de saklayın
not: İstenen tüpü spesifik olarak buharlaştırmak için nitrojen gazı akışına bir cam Pasteur pipeti bağlayın. Ek olarak, tüpü 37 °C'de tüpler için kuru bir blok ısıtıcı içinde tutun. Çözücü buharlaştığında, tüpü kapatmadan önce nitrojen gazı ile doldurun.
- Hücresel kalıntıya 15 mL kloroform: metanol (2: 1) çözeltisi ekleyin. Mikobakteriyel hücre yüzeyinden kovalent bağlı olmayan lipidleri çıkarmak için tüpü gece boyunca sürekli karıştırarak bırakın.
not: Bir orbital sallama platformu mevcut değilse, sürekli karıştırma, mümkün olduğunca sık periyodik manuel karıştırma ile değiştirilebilir.
- Karışımı 1 saat dinlendirin. Bir Pasteur pipeti ile organik çözücüleri geri kazanın. Bir cam huniyi bir filtre kağıdı ile örtün ve organik çözücüleri filtreleyin ve bunları daha önce adım 1.3'te kullanılan aynı cam tüpte toplayın. Tüpteki sıvı fazı buharlaştırmak için bir nitrojen gazı akışı kullanın. Tüpü nitrojen gazı ile doldurun, kapatın ve tekrar 4 °C'de saklayın.
2. Asit metanolizi ile mikolik asit ekstraksiyonu (Şekil 2A)
- PTFE astar vidalı kapaklı hermetik bir cam tüpe 2-5 mL esterleştirici çözelti ekleyin. Cam tüpe 0.2 g mikobakteri biyokütlesi ekleyin.
not: Esterleştirici çözelti, 30 mL metanol, 15 mL toluen ve 1 mL sülfürik asit karıştırılarak oluşturulur. Mikobakteri hücreleri, katı kültürlerden veya mikobakterilerden toplam kovalent bağlı olmayan lipidlerin ekstraksiyonu gerçekleştirildikten sonra delipide edilmiş hücrelerden alınabilir (adım 1.6'da filtrelemeden sonra kalan hücreler).
Dikkat: Toluen yanıcı ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Sülfürik asit aşındırıcı ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
- İçeriği girdap yaparak karıştırın. Karışımı gece boyunca 80 ° C'de kuru bir banyoda bekletin.
- Tüpün oda sıcaklığına ulaşana kadar soğumasını bekleyin ve ardından tüpe 2 mL n-heksan ekleyin. İçeriği 30 saniye boyunca girdaplayarak karıştırın ve iki net faz görünene kadar tüpün oturmasına izin verin.
DİKKAT: n-hekzan potansiyel olarak yanıcı, tahriş edici, çevreye zarar veren ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
- N-heksan fazına karşılık gelen üst fazı geri kazanın. Yeni bir tüpe aktarın.
- Adım 2.3'ü tekrarlayın. Üst fazı tekrar geri kazanın ve adım 2.4'te kullanılan aynı tüpe aktarın.
- Bir nitrojen gazı akışı kullanarak tüpün içeriğini buharlaştırın. Tüpü nitrojen gazı ile doldurun, kapatın ve 4 °C'de saklayın.
3. Sabunlaştırma ve metilasyon yoluyla mikolik asit ekstraksiyonu (Şekil 2B)
- Katı bir ortamdan 0.2 g mikobakteri kazıyın ve PTFE vidalı kapaklı bir cam tüpe ekleyin.
- % 5 potasyum hidroksit içeren 2 mL metanol-benzen çözeltisi (80:20) ekleyin. İçeriği girdap yaparak karıştırın. Karışımı 100 °C'de 3 saat ısıtın.
Dikkat: Benzen yanıcı, kanserojen ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
- Tüpün oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. pH = 1 elde etmek için numuneleri asitleştirmek için% 20 sülfürik asit ekleyin.
- 3 mL dietil eter ekleyin. İçeriği girdap yaparak yavaşça karıştırın.
- Yerleşerek iki fazın oluşmasına izin verin. Dietil eter fazını geri kazanın ve yeni bir tüpe aktarın. Yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın.
- Dietil eter ekstraktını 2 mL damıtılmış su ile yıkayın ve dietil etere karşılık gelen üst kısmı yeni bir tüpe aktarın. Yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın.
- Kurutmak için dietil eter ekstraktının üzerine 2 g susuz sodyum sülfat ekleyin.
- Süspansiyonu filtreleyin. Bir nitrojen gazı akışı kullanarak içeriği buharlaştırın.
- Metilasyon adımını gerçekleştirmek için, 3 g N-nitroso-N-metil üreyi, damıtılmış suda 45 mL dietil eter ve 9 mL %40 KOH ile oluşturulan önceden soğutulmuş bir çözelti içinde çözün.
Dikkat: N-nitroso-N-metilüre toksik, tahriş edici, kanserojen ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
- Süpernatanı (diazometan), potasyum hidroksit peletleri (yaklaşık 30 g) içeren buzda soğutulmuş yeni bir şişeye aktarın.
not: Süpernatan hemen kullanılmazsa, -20 °C'de maksimum 1 h.
Dikkat: Potasyum hidroksit peletleri tahriş edici ve aşındırıcı bir maddedir. Bu malzeme, uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Diazometan oldukça zehirlidir ve potansiyel olarak patlayıcıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek güvenlik camlı bir laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
- Adım 3.10'da elde edilen diazometan içeren eter çözeltisinin 2 mL'sini, adım 3.8'de elde edilen mikolik asitler içeren kurutulmuş dietil eter ekstraktına ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Süspansiyonu 40 °C'de buharlaştırın. Tüpü nitrojen gazı ile doldurun, kapatın ve metillenmiş lipitleri 4 °C'de saklayın.
not: Eter sarı rengi kaybedene kadar laminer akış başlığı altındaki eter çözeltisinden diazometanı buharlaştırın.
4. İnce tabaka kromatografisi (TLC) analizi
- Cam TLC haznesini doyurun. Bunu yapmak için, TLC odasının duvarlarından birini bir parça filtre kağıdı ile örtün ve çözücülerin karışımından oluşan mobil faz ile temas etmesine izin verin. Çözücünün kalan hacmini TLC haznesinin altına yerleştirin.
not: TLC haznesinin tabanı en az 1 cm mobil faz ile kaplanmalıdır. Mevcut deneylerde, TLC'leri geliştirmek için farklı mobil fazlar kullanılmıştır. 85 mL n-heksan artı 15 mL dietil eterden oluşuyordu; 100 mL diklorometan; 90 mL kloroform, 10 mL metanol ve 1 mL su; 30 mL kloroform, artı 8 mL metanol ve 1 mL su; 60 mL kloroform, artı 35 mL metanol ve 8 mL su; 95 mL kloroform artı 5 mL metanol; ve 90 mL petrol eteri (60-80 °C) artı 10 mL dietil eter.
not: İki boyutlu TLC'de, birinci yönde üç kez n-heksan: aseton (95: 5) kullanın ve mikolik asit bileşimini analiz etmek için ikinci yönde toluen: aseton (97: 3) ile tek bir geliştirme kullanın. PIM'leri analiz etmek için, birinci yönde bir kez kloroform: metanol: su (60:30:6) kullanın ve ikinci yönde kloroform: asetik asit: metanol: su (40:25:3:6) kullanın. PDIM ve AG'yi analiz etmek için, birinci yönde üç kez petrol eteri (60-80 °C): etil asetat (98: 2) kullanın ve ikinci yönde petrol eteri (60-80 ° C): aseton (98: 2) ile tek bir geliştirme kullanın.
Dikkat: Dietil eter potansiyel olarak toksik ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Diklorometan, potansiyel olarak toksik ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Petrol eteri potansiyel olarak yanıcı, çevreye zarar veren ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Asetik asit, potansiyel olarak yanıcı ve aşındırıcı bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Etil asetat yanıcı ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Aseton yanıcı ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
- En az 20 dakika doyurmak için TLC haznesini kapatın. Bu arada, cam tüpte bulunan lipitleri 0.2-1 mL kloroform.
içinde çözün
not: Lipitleri çözmek için kullanılan hacim, numunenin istenen veya beklenen konsantrasyonuna bağlı olarak değiştirilebilir.
- Doğrudan TLC plakasına bir kılcal cam tüp kullanarak her süspansiyondan 10 μL uygulayın ve numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika kurumaya bırakın.
not: Numuneler, her iki tarafta 1 cm kalacak şekilde plakanın alt kısmına uygulanmalıdır. Numuneler en az 0,5 cm boyunca birbirinden ayrılmalıdır. Numune plaka üzerine uygulandıktan sonra, tüpler tekrar nitrojen gazı ile buharlaştırılabilir ve daha fazla kullanım için 4 °C'de saklanabilir.
- Plakayı, mobil fazı içeren doymuş TLC haznesine yerleştirin. Mobil fazın TLC.
üzerinden çalışmasına izin verin
not: TLC haznesine uygulanan herhangi bir hareket, plaka üzerinde çalışan çözücüyü etkiler ve lipit hareketliliğini etkiler. İki boyutlu TLC'nin gerçekleştirilmesi durumunda, her iki elüsyon sistemini de içermek için iki TLC odası gereklidir.
- Çözücü plakanın üst ucundan 1 cm mesafeye ulaştığında plakayı TLC haznesinden çıkarın. Silika tamamen kuruyana kadar plakayı laminer akı altında bırakın.
not: Mikolik asit bileşiminin n-heksan ve dietil-eter (85:15) kullanılarak analiz edilmesi durumunda, mobil fazı TLC plakası üzerinde üç kez çalıştırana kadar 4.4 ve 4.5 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
- Gerekli leke ile plakayı ortaya çıkarın; gerekirse plakayı ısıtın.
not: Mevcut deneyde, TLC plakalarını püskürtmek için aşağıdaki çözeltilerden 15-20 mL kullanılmıştır: plaka parlak sarı olana kadar etanol içinde% 10 Molibdatofosforik asit hidrat, ardından plaka 120 ° C'de ısıtılır; Sülfürik asitte %20 α-naftol etanol içinde %5, ardından plakanın 120 °C'de ısıtılması; Molibden Mavisi reaktifi (4,2 M sülfürik asit içinde %1,3 molibden oksit) fosfat bantları ortaya çıkana veya sülfürik asitte %1 anthrone olana kadar.
Dikkat: Molibdatofosforik asit hidrat yanıcı ve aşındırıcı bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Etanol potansiyel olarak yanıcı ve tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
DİKKAT: 1-Naftol yanıcı, aşındırıcı ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
Dikkat: Molibden Mavi Sprey Reaktifi aşındırıcı, toksik ve son derece tehlikeli bir maddedir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldivenler) giyilerek laminer akış başlığında kullanılmalıdır.
