$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kromatografi Sisteminin Hazırlanması
- Numune ve tampon hatlarının her birini steril su, 1 N sodyum hidroksit, su ve yıkama tamponu (150 mM sodyum klorür, pH 7.0 içeren 20 mM sodyum fosfat tamponu) ile 50 mL/dk'lık doğrusal akış hızında sırayla durulayarak kromatografi sistemini hazırlayın.
- Sıralı olarak çalışan kolon temizleme tamponu (2 M sodyum klorür, pH 7.0 içeren 5 CV steril 20 mM sodyum fosfat tamponu) ve 7 mL / dk'lık doğrusal akış hızında 5 CV yıkama tamponu ile bir heparin 50 μm kolon (10 × 10 cm, 7.9 mL kolon hacmi (CV)) hazırlayın.
2. Bakulovirüs Vektörünün Saflaştırılması
- Kromatografi sistemini aşağıdaki gibi kurun:
- Bakulovirüs süpernatantını yüklemek için numune yükleme giriş portunu kullanın.
- Yıkama tamponunu yüklemek için tampon giriş portu A1'i kullanın. En az 500 mL yıkama tamponu olan bir şişe hazırlayın ve yıkama tamponu hattını şişeye yerleştirin.
- Elüsyon tamponunu yüklemek için tampon giriş portu A2'yi kullanın (1,5 M sodyum klorür ile 20 mM sodyum fosfat, pH 8.0). En az 500 mL elüsyon tamponu içeren bir şişe hazırlayın ve elüsyon tampon hattını şişeye yerleştirin.
- Kolon geçişli bakulovirüs süpernatanı, yıkama tamponu ve ayrıştırılmış bakulovirüsü toplamak için fraksiyon toplayıcıya birkaç 50 mL konik tüp yerleştirin.
- Heparin kolonunu, 7.0 mL / dk'lık doğrusal bir akış hızında beş adet 7.9 mL kolon hacmi (CV) yıkama tamponu (40 mL) ile dengeleyin.
- Kromatografi sisteminin numune pompasını (giriş numune portu) kullanarak 2.0 mL/dk'lık doğrusal akış hızında heparin kolonuna 250 mL bakulovirüs süpernatanı yükleyin.
- Ultraviyole (UV) absorbans eğrisi (280 nm) taban çizgisine dönene ve stabil hale gelene kadar 2.0 mL / dk'lık doğrusal bir akış hızında heparin kolonundan 10 CV (80 mL) yıkama tamponu çalıştırın.
- Bakulovirüs partiküllerini 7.9 mL heparin kolonundan 5 CV (40 mL) elüsyon tamponu ile 4.0 mL / dk'lık doğrusal akış hızında elute edin. Baculovirus partikülleri heparin kolonundan ayrıldığında kromatogramda proteinin keskin bir elüsyon zirvesini izleyin.
- Elüsyon sonrası, sonraki santrifüjleme sırasında bakulovirüs partiküllerinin ozmotik şoktan inaktivasyonunu önlemek için suda 20 mM sodyum fosfat tamponu kullanarak ayrıştırılmış bakulovirüs süpernatantını hemen 10 kat seyreltin.