Katyon Değişim Kromatografisi: Net Yüzey Yüküne Dayalı Olarak Böcek Hücresi Lizatından Hedef Rekombinant Proteini İzole Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Agamasu, C. et al. Tamamen İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteinin İzole Edilmesi ve Karakterize Edilmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, böcek hücresi protein lizatından rekombinant proteini izole etmek için katyon değişim kromatografisi tekniğini göstermektedir.

Protokol

1. Protein saflaştırma

1. Tablo 1'de görüldüğü gibi A-H arabelleklerini hazırlayın.

Tampon çözelti	Tamponlama maddesi (tümü 20 mM)	Ph	NaCl (mM)	İmidazol (mM)	MgCl2	TCEP (Türkçe)
Bir	HEPES ÜNİVERSİTESİ	7.3	300	-	5	1
B	HEPES ÜNİVERSİTESİ	7.3	300	35	5	1
Ç	HEPES ÜNİVERSİTESİ	7.3	300	500	5	1
D	Mes	6,0	200	-	5	1
E	Mes	6,0	-	-	5	1
F	Mes	6,0	100	-	5	1
G	Mes	6,0	1000	-	5	1
H	HEPES ÜNİVERSİTESİ	7.3	300	-	1	1

1. Saflaştırma malzemelerini hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız): EDTA veya diğer şelatörler içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli; immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) kolonu; katyon değişim kromatografisi (CEX) kolonu; 0.45 μm şırınga filtresi; 2 M imidazol (pH = 7.5); 100.000 x g kapasiteli ultrasantrifüj; 4.000 x g kapasiteli yüksek hızlı tezgah üstü santrifüj; santrifüj filtre üniteleri (10 KDa NMWL); 280 nm'de okuyabilen spektrofotometre; His6-tütün aşındırma virüsü (TEV) proteazı; ve iki tampon çözeltisini karıştırabilen, çözeltileri sütunlara uygulayabilen, sütundan gradyan elüsyonları oluşturabilen ve sütunlardan fraksiyonları toplayabilen kromatografi enstrümantasyonu.
2. Böcek hücresi lizatını diyalizden çıkarın ve herhangi bir çökeltiyi gidermek için 10 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin. Bu noktada son diyalize edilmiş, arıtılmış numune hala genellikle pusludur, ancak sonraki CEX kolonuna daha fazla işlem yapılmadan uygulanabilir.
3. 20 mL'lik bir katyon değişim sütunu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) üç CV Tampon G ile, ardından üç CV Tampon F.
   not: Diğer reçineleri titizlikle değerlendirmemiş olsak da, birkaç meslektaşımız SP Sefaroz Yüksek Performanslı reçine dışındaki reçinelerle düşük çözünürlük bulmuştur.
4. Diyalize edilmiş numunenin 20 mL'sini 20 mL Tampon E ekleyerek 100 mM'lik nihai NaCl konsantrasyonuna seyreltin ve seyreltilmiş numuneyi katyon değişim kolonuna uygulayın.
5. Önceki seyreltme yükün sonuna yaklaşırken, yukarıda açıklandığı gibi hazırlanmış taze seyreltilmiş numuneleri yük tüpüne ekleyerek sütunu yüklemeye devam edin.
   not: Tüm numunenin bir kerede 100 mM NaCl'ye seyreltilmesi, çökelme nedeniyle önemli ölçüde hedef protein kaybına neden olmuştur.
6. Sütunu Abs280 taban çizgisine kadar Tampon F ile yıkayın. Bu genellikle 3 CV gerektirir. Protein, Tampon F'den %65 Tampon G'ye kadar 400 mL (20 CV) gradyan sırasında kolondan ayrılır ve 6 mL fraksiyonlarda toplanır (Şekil 1B).
7. Gradyan tamamlandıktan sonra sütunu ek bir 1.5 CV (%65 Tampon G) için yıkamaya devam edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Saflaştırma işleminin SDS-PAGE jelleri. (A) Lizattan IMAC yakalama. FNTA/B, ~48 kDa'da göç eden karanlık bantlardır ve His6-MBP-tev-KRAS4b, ~67 kDa'da göç eden karanlık banttır. M = protein moleküler ağırlık merdiveni; T = toplam protein; L = arıtılmış lizat/kolon yükü; F = sütun akışı. Fraksiyonlar, artan bir imidazol konsantrasyon gradyanı ile ayrıştırılır. (B) 1-5 olarak eti...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,8 mL Güvenli Kilitli Tüpler, Doğal	Eppendorf Belediyesi	22363204
11 mm Cl SS Kilitli Geçmeli Otomatik Numune Alma Cihazı Şişeleri	Termo Bilimsel	30211SS-1232
5427R Santrifüj	Eppendor (Eppendor)
Asetonitril, HPLC Sınıfı	Fisher Kimya	A998-1 1L
Katyon Değişim Kromatografisi (CEX) sütunu	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	29018183	HiPrep SP Sefaroz Yüksek Performans
Exactive Plus EMR Kütle Spektrometresi	Termo Bilimsel
Gilson şişeleri 7x14 mm Tüpler	GE Sağlık	BR-1002-12
Yüksek hızlı/tezgah üstü santrifüj	Thermo Fischer Bilimsel	05-112-114D	4.000 xg'ye kadar kapasite
His6-Tütün Aşındırma Virüsü (TEV) proteazı	Ekle	92414	Raran-Kurussi ve ark. (2017) TEV Proteaz ile Afinite Etiketlerinin Çıkarılması. İçinde: Burgess Brown N. (eds) E.coli'de Heterolog Gen Ekspresyonu. Moleküler Biyolojide Yöntemler, vol 1586. Humana Basın, New York, NY
EDTA veya diğer şelatörler içermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Kırlangıç Sigma	P8849 Serisi
Amonyum Asetat	Sigma-Aldrich	09689-250g
Argon gazı	Hava gazı	ARUP (ARUP)
Formik Asit	Sigma-Aldrich	F0507-500MI	Reaktif Derecesi veya daha iyisini kullanın
NGC Kromatografi Sistemi	BioRad (BiyoRad	78880002	NGC QuestTM 100 Kromatografi sistemi
Tutuculu lipid ekstruder seti	AVANTI POPOLAR LİPİDLER	610023
Sıvı nitrojen	Hava gazı	NI-DEWAR
Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri, 10K NMWL	Kırlangıç Sigma	UFC901008	PES zarı
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Santrifüj Filtreleri	Amikonya	UFC501024
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	Optima - L80K	100.000 xg kapasiteli
Çelik	Sigma	C3023