$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Tamponların hazırlanması
- ELISA yıkama tamponunu hazırlamak için 1 L deiyonize (DI) suya 3.94 g Tris-baz, 8.77 g NaCl ve 1 g sığır serum albümini (BSA) ekleyin. 500 μL polisorbat-20 ekleyin. HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
- Blokaj tamponunu hazırlamak için 3.94 g Tris-baz, 8.77 g NaCl ve 10 g BSA ekleyin. 1 L DI suya 500 μL polisorbat-20 ekleyin. HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
- Elüsyon tamponunu (PBS) hazırlamak için 8.01 g NaCl, 2.7 g KCl, 1.42 gNa2HPO4ve 0.24 g KH2PO4 ila 1 L DI su ekleyin. HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
not: Bu tamponun 10x'lik bir çözeltisi yapılabilir ve gerektiğinde DI suyu ile seyreltilebilir.
2. OMV numunesinin hazırlanması
- A. actinomycetemcomitans hücrelerini geç üstel faza kadar büyütün (600 nm'de 0.7'de optik yoğunluk). 10 dakika boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'da iki kez santrifüjleyerek hücreleri peletleyin. Süpernatanı 0,45 μm'lik bir filtreden süzün.
- Bakteri içermeyen süpernatanı 50 kDa-moleküler ağırlık kesme filtreleri kullanarak konsantre edin. Konsantre çözeltiyi 105.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca ultrasantrifüj edin.
- Peleti PBS ve ultrasantrifüjde tekrar süspanse edin (30 dakika boyunca 4 ° C'de 105.000 x g.) Peleti 2 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
3. S-1000 sütununun paketlenmesi
- Jel filtrasyon ortamının stok şişesini bir cam karıştırma çubuğu ile karıştırın ve sütunu doldurmak için gerekli hacmi ve yaklaşık% 50 fazlalığı (yaklaşık 135 mL) bir cam şişeye dökün. Bu boncuklar yerleşene kadar bekletin ve ardından fazla sıvıyı boşaltın. Boncukları elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin, böylece nihai çözelti yaklaşık% 70 (hacimce) jel,% 30 tampon olur. Çözeltiyi vakum altında gazdan arındırın.
- Cam sütunu bir halka sehpa kullanarak dikey olarak monte edin ve kolonun duvarlarını ıslatmak için elüsyon tamponu ile doldurun. Sütunda yalnızca yaklaşık 1 cm tampon kalana kadar tamponu boşaltın.
- Kabarcıklar oluşturmadan, boncukları sütuna dikkatlice pipetleyin ve sütunu en üste kadar doldurun. Bu işlem boyunca fazla arabelleği boşaltmaya devam edin. Sütunun üst kısmına ek boncuklar eklemeden önce boncukların tamamen oturmasına izin vermediğinizden emin olun. Kolon, kolon rezervuarının tabanının yaklaşık 2 cm altında bir yüksekliğe kadar paketlenmelidir.
4. Numunenin yüklenmesi ve fraksiyonların toplanması
- Elüsyon tamponunun gazını vakum altında alın. Sütunu iki sütun hacmi (180 mL) elüsyon tamponu ile yıkayın.
- Kalan arabelleğin sütuna tam olarak girmesine izin verin. Tampon jel tabakasının tepesine ulaştığında, OMV'ler içeren 2 mL'lik bir numuneyi (yaklaşık 100 - 200 nmol / L lipid konsantrasyonunda) boncukların yüzeyine dikkatlice pipetleyin ve kolonun üst kısmındaki boncukların hiçbirini rahatsız etmemeye dikkat edin. Numunenin jele tam olarak girmesine izin verin, yani jel tabakasının üzerinde sıvı kalmadığında.
- Jel kolonunun üzerine dikkatlice ve yavaşça elüsyon tamponu ekleyin. Numunenin seyreltilmesine neden olacağından jelin üst tabakasını rahatsız etmeyin.
- Kolonun altına 50 mL'lik tek bir tüp yerleştirin ve kolonu açın. Eluentin ilk 20 mL'sini toplayın. Kolonun asla kuru kalmamasını sağlamak için gerektiği kadar dikkatli bir şekilde kolonun üst kısmına ek elüsyon tamponu ekleyin.
- Kolonun altına bir dizi 1,5 mL tüp yerleştirin. Sütunu başlatın ve her tüpte bir dizi 1 mL'lik numune toplayın. Numuneler toplanırken, gerektiği gibi sütunun üst kısmına elüsyon tamponu eklemeye devam edin. 96 kesir toplanana kadar tekrarlayın. Sütunu durdurun.
not: Numuneler, daha fazla analize kadar uzun süreli depolama için -20 °C'de veya kısa süreli depolama için 4 °C'de saklanmalıdır.
- Sütunu temizlemek için, sütundan 90 M NaOH'lik bir sütun hacmi (0.1 mL) geçirin. Sütun boyunca iki sütun hacmi (180 mL) elüsyon tamponu çalıştırın.