1. Antikoru Üretin ve Karakterize Edin
- Antikoru ifade edin
- 100 birim / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve 250 ng / mL amfoterisin B ile desteklenmiş 50 mL ekspresyon ortamı içeren 250 mL'lik bir şişede bir HEK süspansiyon hücresi şişesini çözün. Hücreleri 125 rpm'de bir çalkalayıcı ile donatılmış nemlendirilmiş inkübatörlerde% 8 CO2 ile 37 ° C'de tutun. Transfekte etmeden önce hücreleri en az 2 kez 0.3-0.5 x 106 hücre / mL'ye (her 2-3 günde bir) bölün.
- 2.5 x 106 hücre / mL yoğunluğa ulaşıldığında (bölünmeden 2-3 gün sonra), 100 mM CypK'lik taze bir çözelti hazırlayın. Bu amaçla, 64 mg CypK ağırlığında, 2.5 mL 0.1 sodyum hidroksit ekleyin, girdap, tüm çözünmemiş parçacıkları geri kazanmak ve sonikat için aşağı döndürün.
- Antibiyotiklerle takviye edilmiş 42.5 mL ekspresyon ortamına 2.5 mL CypK (0.1 M NaOH'de 100 mM) ekleyin. İyice karıştırın, 250 μL 0.1 M HCl ekleyin ve 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin.
- 50 μg HC ve LC pKym1 plazmitlerini azaltılmış serum ortamı ile 2.5 mL'ye seyreltin. Ayrı bir tüpte, 135 μL transfeksiyon reaktifini azaltılmış serum ortamı ile 2.5 mL'ye seyreltin.
- Çözeltileri hazırladıktan beş dakika sonra, plazmitleri ve transfeksiyon reaktif solüsyonunu karıştırın ve DNA ile transfeksiyon reaktifi arasında komplekslerin oluşumuna izin vermek için 20 dakika inkübe edin.
- Bu arada, hedef yoğunlukta 125 milyon hücreyi 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, CypK içeren ekspresyon ortamı ile yeniden süspanse edin ve DNA-transfeksiyon reaktif karışımını ekleyin. CypK, daha önce bildirildiği gibi satın alınabilir veya sentezlenebilir.
- Hücreleri 20 saat inkübe ettikten sonra, kitte bulunan 250 μL transfeksiyon reaktif arttırıcıları ekleyin.
- CypK ilavesinden 6-7 gün sonra süpernatanttan antikorları toplayın (ekspresyon sırasında ortam değişikliği gerekmez).
*Alternatif olarak, daha yüksek ve daha tutarlı verimler elde etmek için, Oller-Salvia ve ark. 2018'de açıklandığı gibi kararlı bir hücre hattı oluşturulabilir. Bu durumda, trastuzumab(CypK)2, ekspresyon ortamına basitçe CypK 5 mM eklenerek ifade edilir.
- Antikoru saflaştırın
- Hücreleri 3000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı 0,45 veya 0,22 μm filtre ile filtreleyin. Filtre tıkanırsa, yenisiyle değiştirin ve filtrelemeye devam edin. Bu sadece birkaç mililitre sonra gerçekleşirse, süpernatanı 7000 x g'da 15 dakika daha santrifüjleyin.
- Boş bir polipropilen kromatografi kolonuna protein A reçinesi (2 mL / 100 mL süpernatant) ekleyin ve reçineyi en az 5 hacim boncuk yıkama tamponu (0.1 M sodyum fosfat, 150 mM NaCl) ile dengeleyin.
- Süpernatanı iki adet 50 mL konik tüpe bölün ve 5x boncuk yıkama tamponu (0.5 M sodyum fosfat, 150 mM NaCl) ve ardından önceden dengelenmiş protein A reçinesi ekleyin. Süpernatanttaki antikoru aşağı çekmek için konik tüpü oda sıcaklığında 3 saat boyunca bir silindire yerleştirin.
- Alternatif olarak: Süpernatanı, önerilen reçine hacminin en az iki katı olacak şekilde kolona ekleyin ve akmasına izin verin. SDS-PAGE tarafından süpernatantta önemli miktarda antikor kalmadığından emin olun. Varsa, süpernatanı reçineden bir kez daha çekin.
- Protein A reçinesini süpernatan ile bir kolona aktarın ve sıvının akmasına izin verin.
- 25 mL yıkama tamponu (veya en az 10 reçine hacmi) ekleyin ve akmasına izin verin.
- Antikoru 4 mL 0.1 M sodyum sitrat, pH 3, 1 mL 1 M fosfat tamponu, 150 mM NaCl üzerinde elute edin.
- Antikoru 10 mL PBS ile seyreltin, santrifüjlü filtrasyon ile 0.5-1 mL'ye konsantre edin ve tamponu PBS ile üç kez değiştirin.
- Yüksek tuzlu tamponda (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM sodyum fosfat pH 7.0, %5 izopropanol) 30 dakikalık düşük tuz tamponunda (50 mM sodyum fosfat pH 7.0, %20 izopropanol) 0,5 mL/dk akışlı ve %0-100 gradyanlı bir bütil HIC sütunu kullanarak numuneleri FPLC ile saflaştırın. Tüm fraksiyonları toplayın ve elüsyonu 280 nm'de izleyin. Verimi ve saflığı en üst düzeye çıkarmak için küçük miktarlar (1 mg'ın <), 2.4'te açıklanan koşullar altında HPLC-HIC ile saflaştırılabilir.
- Antikor içeren fraksiyonları bir araya getirin, PBS ile en az 4 mL'ye seyreltin, santrifüjlü filtrasyon ile konsantre edin ve PBS ile üç kez tampon değiştirin.
- Antikoru ölçün
- Mikro hacimli bir spektrofotometre kullanarak 280 nm'de absorbansı ölçerek yaklaşık bir konsantrasyon elde edin.
- Doğru bir ölçüm gerekiyorsa, insan IgG'lerini ölçmek için bir ELISA kiti kullanın. Kaba bir tahmin için, SDS-PAGE'i Coomassie bazlı bir leke ile aşağıdaki gibi kullanın:
- ELISA tarafından 1 mg / mL'de ölçülen bir trastuzumab standardını altı kez iki kat seyrelterek standartları hazırlayın.
- Yükleme tamponunu azaltmak için standartları ve numuneleri yaklaşık 0.25 mg / mL'de kaynatın.
- Bunları MES-SDS tamponu kullanarak %4-12 Bis-Tris SDS-PAGE'de çalıştırın ve Coomassie bazlı bir boya ile boyayın. Son olarak, ImageJ kullanarak hafif veya ağır zincire karşılık gelen bandın renk yoğunluğunu ölçün ve örneklerden gelen sinyali standart eğride enterpolasyon yapın.
- Antikoru 4 °C'de saklayın.
2. Antikoru Konjuge Edin ve ADC'yi Karakterize Edin
- Antikoru tetrazin içeren molekül ile konjuge edin
- 10 molar tetrazin-vcMMAE eşdeğerini (4 μL, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 3.4 mM) 20 μL asetonitril ve 76 μL PBS ile küçük bir konik tüpte (örn., PCR tüpü).
- 1 molar eşdeğeri trastuzumab(CypK)2 (PBS'de 100 μL, 2 mg/mL) ekleyin, iyice karıştırın ve trastuzumab(MMAE)2.
oluşturmak için oda sıcaklığında (25 °C) 3 saat reaksiyona girmesine izin verin
not: Tetrazin-5-TAMRA gibi diğer moleküller, bu protokol kullanılarak tetrazin-vcMMAE yerine antikora bağlanabilir.
- ADC'yi saflaştırın
- Üreticinin talimatlarını izleyerek PBS ile bir boyut dışlama döndürme sütununu önceden dengeleyin.
- Reaksiyonun tüm hacmini spin kolonuna ekleyin ve 1 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin.
- ADC'yi ölçün ve eşleniği SDS-PAGE ile analiz edin
- ADC'yi 1.3.2'de açıklandığı gibi ölçün. standart eğri için modifiye edilmemiş antikoru kullanarak bir SDS-PAGE üzerindeki hafif zincirin renk yoğunluğunu ölçerek.
- Ağır zincir, konjugasyon üzerine moleküler ağırlıkta bir artış göstererek hafifçe kaymış olmalıdır.
Not: Antikor, trastuzumab (TAMRA) 2'deki gibi bir florofor ile modifiye edilirse, boyamadan önce sadece ağır zincire karşılık gelen bant jel içi floresan göstermelidir.
- Eşleniği HPLC-HIC ile analiz edin
- HPLC-HIC kolonunu %100 tampon A (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM sodyum fosfat pH 7.0, %5 izopropanol) ile 5 dakika dengeleyin.
- 15 μL (67 pmol) 1 mg / mL trastuzumab (CypK) 2 çözeltisini bir şişede 15 μL 2x tampon A ile karıştırın. Daha sonra HPLC'de 10 μL'lik bir enjeksiyon programlayın.
- 1 dakika boyunca% 100 tampon A ile izokratik 1 mL / dak akışta elute edin, ardından B'de tampon A'nın% 100'ünden 0 ila% 15'lik bir gradyan (50 mM sodyum fosfat pH 7.0,% 20 izopropanol). Elüsyonu 280 nm'de izleyin.
- Her bir türe karşılık gelen tepe noktasını entegre ederek ve elde edilen alanları aşağıdaki denklemde kullanarak DAR'ı hesaplayın:
DAR = (1x trastuzumab(MMAE) + 2x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
Trastuzumab (CypK) 2 için beklenen alıkonma süresi 7.5-8.0 dakika, trastuzumab (CypK, MMAE) için 9.1-9.6 dakika ve trastuzumab (MMAE) 2 için 10.5-11.0 dakikadır.