Floresan Algılama Boyut Dışlama Kromatografisi: Deterjan Çözündürmesi Üzerine Floresan Membran Proteinlerinin Bütünlüğünü Belirleme Tekniği

Özet

Kaynak: Bird, L. E., et al. Escherichia coli'de Membran Proteinlerinin Yeşil Floresan Protein Bazlı İfade Taraması. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, deterjan çözünmesini takiben Escherichia coli'de yeşil floresan proteini (GFP) ile kaynaşmış membran proteini stabilitesini taramak için bir floresan algılama boyut dışlama kromatografisi tekniği gösteriyoruz. Boyut dışlama profilinde çok az veya hiç serbest GFP ile simetrik bir tepe sergileyen proteinler, daha sonra yapı-fonksiyon analizi için seçilebilen, minimum bozunma ve agregasyon ile saflaştırılmış proteinleri gösterir.

Protokol

1.Membran Fraksiyonunun Çözündürülmesi ve Analizi

1. Membran fraksiyonunu (gerekirse) çözün ve çözündürme için kullanılacak her deterjan için, membran süspansiyonunun 900 μl'sini 1.5 ml'lik bir poliallomer mikro santrifüj tüpüne alın.
2. Belirtilen 1,5 ml'lik tüpe% 1'lik bir nihai konsantrasyona kadar% 1 taze hazırlanmış deterjandan 100 μl ekleyin (% 10 w / v DDM, DM, Cymal-6 ve LDAO çözeltileri). Ökaryotik membran proteinlerinin çözündürülmesi için deterjanlara kolesterol hemissüksinat (%0.2 nihai konsantrasyon) eklenebilir.
3. Karışımları 4 ° C'de 1 saat boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.
4. Deterjanın çözünmeyen fraksiyonunu bir tezgah üstü ultra santrifüj ile peletleyin, tüplerin en az yarı dolu olmasını sağlayın, 150.000 g'da 4 ° C'de 45 dakika boyunca ve süpernatanı koruyun.
   not: Deterjan çözündürmesinin etkinliği, aynı hacimde PBS içinde yeniden süspanse edilen deterjan çözünmeyen fraksiyon ile çözünmüş membranların GFP floresansının ölçülmesiyle bir floresan plaka okuyucu kullanılarak tahmin edilebilir.
5. Floresan ile tespit edilen boyut dışlama kromatografisi (FSEC) kullanarak farklı deterjan: membran protein komplekslerinin mono dağılımını analiz edin.
6. FSEC analizi için, geniş bir fraksiyonlama aralığına sahip bir boyut dışlama kolonunu, örneğin moleküler ağırlıkta 5.000 ila 5.000.000, çalışan tampon (20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.03 DDM) ile dengeleyin 0.3 ml / dak. Bu tamponu tüm numuneler için kullanın, yani test edilen her deterjan için değiştirilmez.
7. 0,3 ml/dk'lık bir akış hızında kolona 100 μl çözünmüş membran enjekte edin. Floresan optikler kullanarak elüsyon profilini izleyin (488 nm'de uyarma ve 512 nm'de emisyon). Hat içi floresan monitörü mevcut değilse, fraksiyonları toplayın ve floresansı bir plaka okuyucuda okuyun.
8. Elüsyon hacmi ve floresan yoğunluğu verilerini, grafiksel görüntüleme için bir elektronik tablo programına aktarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kolesterol hemisüksinat	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-Sikloheksil-1-Heksil-βD-Maltozit)	Anatrace (Anatrace)	C326
DDM (n-Dodesil β-maltosit)	Nesil	D97002
DM (n-Desil β-maltozit)	Nesil	D99003
LDAO (N,N-Dimetil-ndodesilamin N-oksit)	Nesil	D71111
BenchMark Floresan Protein Standardı	Yaşam Teknolojileri	LC5928
Optima L-100 Ultrasantrifüj 45-Ti rotor ile çalışıyor	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	393253
TLA-55 rotoru çalıştıran Optima Max-XP ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	393315
RF-20A Floresan dedektörü ile Öne Çıkan UFLC	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL boyut dışlama sütunu	GE Sağlık	17-5172-01