DFE Tabanlı Afinite Kromatografisi: Yüksek İyonik Kuvvete Dayalı Elüsyon Koşulları Kullanılarak Ham Bir Numuneden 2F5 Monoklonal Antikorların Saflaştırılması İçin Bir Teknik

Abstract

Kaynak: Knödler, M. et al., Afinite Kromatografi Reçinelerinin Hızlı Gelişimi için Aktive Edilmiş Çapraz Bağlı Agaroz - Bir Vaka Çalışması Olarak Antikor Yakalama. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, DsRed-2F5-Epitop veya DFE ligandlarını kullanarak 2F5 monoklonal antikorları saflaştırmak için bir afinite kromatografisi tekniği açıklanmaktadır. Saflaştırılmış 2F5 monoklonal antikorlar, immünoterapide temel ilaçlardır.

Protocol

1. Arıtılmış Bitki Özlerinden mAb'lerin Saflaştırılmasının Test Edilmesi

1. 2F55 içeren 100 mL arıtılmış bitki özütü veya yine 2F5 içeren tercih edilen hücre bazlı ekspresyon sisteminden süpernatan hazırlayın.
2. Dengeleme tamponu (20 mM sodyum fosfat, 500 mM sodyum klorür, pH 7.4), düşük pH elüsyon tamponu (0.05 M sitrat, 0.05 M sodyum klorür, pH 4.0–3.25) ve yüksek iyonik mukavemetli elüsyon tamponu (1.0–4.0 M magnezyum klorür, 0.1 M HEPES, pH 8.0) hazırlayın
3. Kromatografi sistemini tamponlarla yıkayın. Kromatografi sistemine bir DFE afinite sütunu (Ana protokol metnine bakın) monte edin ve 5 mL ^min-1.0 akış hızında 1 CV dengeleme tamponu ile dengeleyin. UV absorbansını 280 nm.
   'da izleyin not: Bitki özütü veya hücre kültürü süpernatanının kolona yüklenmesi, geri basınçta bir artışa neden olabilir. Kromatografi sistemine veya DFE kolonuna zarar vermemek için 0,2 MPa'da bir yüksek basınç uyarısı ayarlayın.
4. 2 dakikalık bir temas süresini garanti etmek için 80 mL arıtılmış bitki özütü veya süpernatan (adım 1.1) 0.5 mL dk-1 akış hızında kolona yükleyin. Atılım eğrisi rekonstrüksiyonu için akış örneklerini 2 mL'lik fraksiyonlarda toplayın. Anında numune analizi mümkün değilse, akış numunelerini 4 °C'de saklayın.
5. Kolonu 6 CV dengeleme tamponu ile yıkayın. Bu adımın başında, ortasında ve sonunda yıkamanın bir örneğini toplayın.
6. 5 CV düşük pH'lı elüsyon tamponu veya yüksek iyonik mukavemetli elüsyon tamponu (0,1 M HEPES, 1,25 M magnezyum klorür, pH 8,0) ile mAb 2F5'i elute edin. UV 280 nm sinyali taban çizgisinin 5 mAU üzerine çıktığında DFE fraksiyonunu toplayın.
   1. Her epitop-antikor çifti için elüsyon tamponunu optimize edin. 2F5 için 1,25 M magnezyum klorür, ürün geri kazanımı ve ligand stabilitesi arasında optimum bir denge sağladı.
      not: Magnezyum klorür çözeltisi çökelmeye eğilimlidir. Bu nedenle, magnezyum klorürü ~ 700 mL suda çözün. HEPES'i 100 mL suda ayrı olarak çözün ve pH'ı 8.0'a ayarlayın. Çözünmüş magnezyum klorür çözeltisini HEPES çözeltisine ekleyin ve 1.0 L'lik bir nihai hacme kadar su ekleyin. Magnezyum klorürü çözdükten sonra pH'ı ayarlamayın çünkü bu çökelmeye neden olur.
7. Bradford yöntemi, lityum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (LDSPAGE) ve yüzey plazmon rezonansı (SPR) spektroskopisi kullanılarak adım 1.4-1.6 sırasında alınan tüm örnekleri analiz edin.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DsKırmızı	Fraunhofe IME	Yok	Standart
HiTrap NHS ile aktive edilen Sefaroz HP, 1 mL	GE Sağlık Hizmetleri	17-0716-01	Kromatografi sütunları
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Carl Roth GmbH	9105.3	Tampon bileşeni
Magnezyum klorür	Carl Roth GmbH	KK36.2	Tampon bileşeni
PH 3110	Dünya Kupası	2AA110	pH metre
Sephadex G-25 ince, çapraz bağlı dekstran	GE Sağlık Hizmetleri	17003301	Kromatografi reçinesi
Sodyum klorür	Carl Roth GmbH	P029.2 Serisi	Tampon bileşeni
Sodyum sitrat	Carl Roth GmbH	HN13.2	Tampon bileşeni