İnce Tabaka Kromatografisine Dayalı Enzim Aktivitesi Deneyi: İnce Tabaka Kromatografisi Kullanılarak İn Vitro Pirofosfokinaz Aktivitesini Belirleme Tekniği

Özet

Kaynak: Pokhrel, A., et al. Clostridium difficile'den bir (p)ppGpp Sentetaz için Saflaştırma ve İn Vitro Aktivite Testi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, radyoaktif işaretli nükleotidler kullanarak pirofosfokinaz aktivitesini belirlemek için ince tabaka kromatografisi tabanlı bir enzim testi gösterilmektedir. Yöntem, nükleotid sentezi ve fosfotransfer reaksiyonları hakkında bilgi sağlar.

Protokol

1. İnce Tabaka Kromatografisi ile Protein Aktivitesi Testi

1. İnce tabaka kromatografisi (TLC) plakasını hazırlayın.
   1. Deiyonize suda yıkayarak polietilenimin (PEI)-selüloz plakaları hazırlayın. Plakaları ~ 0,5 cm derinliğe kadar çift damıtılmış su içeren bir cam hazneye yerleştirin.
   2. Suyun plakanın üstüne geçmesine izin verin.
      NOT: Plakaların yıkanması kesinlikle gerekli değildir, çünkü plakalar onsuz da kullanılabilir, ancak yıkama, ortaya çıkan görüntülerin netliğini artırır. Plakaların iki dikey yönde yıkanması, reçinede bulunan herhangi bir kirleticinin plakanın bir köşesinde izole edilmesini sağlar (Şekil 1).
   3. Plakaları cam hazneden çıkarın ve gece boyunca (12-18 saat) kuruması için bir tezgah üstü rafta bırakın.
   4. Numunelerin TLC için nereye uygulanacağını belirtmek için kuru plakaları bir kenardan 2.0 cm uzakta yumuşak bir kalemle işaretleyin. 2 μL'lik numuneler için, numuneleri en az 1,0 cm aralıklarla uygulayın (Şekil 1).
      NOT: Bu, sinyal nicelemesi için kritik olan bitişik nokta arasında net bir ayrım yapılmasına izin verir. Selüloz reçinesi çizilmediği sürece, yüzeydeki küçük kalem izleri solvent göçünü engellemez.
   5. Deneyleri planlarken, her tabakta her zaman kullanılmayan bir nokta bırakın.
      NOT: Bu, numune ölçümü için boş bir şerit sağlayacaktır (Şekil 1). 20 cm'lik bir TLC plakası 19 nokta için yer açacaktır.
2. Enzim aktivitesi deneyi
   1. 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM amonyum asetat, 10 mM KCl, 1 mM DTT ve 0.6 mM ATP (adenozin trifosfat) içeren 5x'lik bir tampon karışımı hazırlayın.
      NOT: Bu karışım büyük miktarlarda hazırlanabilir ve daha sonra kullanılmak üzere 10 μL'lik alikotlarda dondurulabilir. Karışımı birden fazla donma-çözülme döngüsüne maruz bırakmayın.
   2. 3 μM RSH (Rel / Spo homolog enzimleri), 1x tampon karışımı, 0.6 mM GDP (guanozin difosfat), 1.2 mM MgCl₂ içeren bireysel reaksiyonlar hazırlayın. 10 μL reaksiyon başına 1.0 μCi ^γ-32P-ATP (radyoaktif işaretli ATP) ekleyin ve reaksiyonu istenen hacme getirmek için nükleaz içermeyen su kullanın. Nükleotid içeren karışıma RSH ilavesi enzimatik aktivite testini başlattığından, diğer bileşenler karıştırıldıktan sonra RSH'yi ekleyin.
      NOT: Nihai reaksiyon hacmi, örneklenen zaman noktası sayısına bağlı olacaktır. 2 μL/zaman noktasını örneklemek için, her 4 zaman noktası için 10 μL reaksiyon karışımı birleştirin.
   3. Kirletici nükleaz aktivitesinden ATP hidrolizini kontrol etmek için, protein içermeyen 10 μL'lik bir reaksiyon oluşturun ve paralel olarak inkübe edin. Protein yokluğunda ATP'nin hidrolize olmadığından emin olmak için t = 0'da ve deneyin sonunda 2 μL numuneleri yerleştirin.
   4. RSH eklendikten hemen sonra, 2 μL'yi çıkarın ve t = 0 dakika numune olarak etiketli PEI-selüloz plakaya yerleştirin.
   5. Reaksiyonu 37 °C'de inkübe edin, istenen zaman noktalarında 2 μL alikot çıkarın.
      NOT: Numune selüloz plaka üzerine adsorbe edildiğinde enzimatik aktivite duracaktır. Tam adsorpsiyon ve numune kurumasını sağlamak için geliştirmeden önce son nokta plakaya eklendikten sonra 10-30 dakika bekleyin.
3. İnce tabaka kromatografisi
   1. Kromatografi odasını 1,5 M 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,64) ile 0,5 cm.
      derinliğe kadar doldurun NOT: İhtiyaç duyulan hacim, kromatografi tankının boyutlarına bağlı olacaktır. TLC plakasının bükülmeden yerleştirilmesine izin verecek kadar geniş bir düz tabana sahip herhangi bir cam kap, bir kapak ilavesiyle geliştirme tankı olarak kullanılabilir. TLC plakası, plastik filmle kaplı bir cam beherde geliştirmeyi sağlamak için temiz bir tıraş bıçağıyla daha dar şeritler halinde kesilebilir.
   2. Plakanın alt kenarını çözücüye batırın. Çözücünün plakanın üst kısmına geçmesine izin verin (~ 90 dk).
      NOT: Solvent göçü plakanın üst kısmında duracak ve numuneler daha uzun bir daldırma sırasında kaybolmayacak veya birlikte çalışmayacak olsa da, plakalar gece boyunca solvent içinde bırakılmamalıdır. 4 saatten uzun daldırmalar, reçinenin plaka desteğinden ayrılmasına ve sinyal kaybına neden olabilir.
   3. Plakayı kromatografi tankından çıkarın ve bir tezgah üstü kurutma rafına yerleştirin.
   4. Plakanın gece boyunca kurumasını bekleyin.
      NOT: Kurutma işlemi bir saç kurutma makinesi kullanılarak hızlandırılabilir. Kuruluk, ıslandığında koyulaşacak ve tamamen kuruduğunda kullanılmayan bir plakanın rengine geri dönecek olan reçinenin rengi ile değerlendirilebilir.
   5. Plaka kuruduktan sonra, radyoaktif materyalin görüntüleme kasetine aktarılmasını önlemek için plakayı plastik filme sarın ve otoradyografi ile analiz edin (Şekil 2).
4. Veri analizi
   1. Ayrılmış reaksiyonları içeren PEI-selüloz plakayı oda sıcaklığında 4 saat boyunca bir fosfor görüntüleyici kasetine maruz bırakın.
      NOT: Bu, belirtilen taze ^γ-32P-ATP konsantrasyonlarını kullanarak çok net bir görüntü elde etmek için yeterli pozlamadır. Daha düşük miktarlarda radyoaktif işaretli substrat kullanılırsa, maruz kalma süresi 12-16 saate çıkarılabilir.
   2. Kaseti bir fosfor görüntüleyicide görüntüleyin.
   3. Grafiksel kullanıcı arayüzüne sahip görüntüleme yazılımını kullanarak, Dikdörtgen Çiz'i seçerek ve fareyi kullanarak tüm bir şeridin etrafına ve bu şeritte bulunan ATP ve ppGpp (Guanozin tetrafosfat) noktalarının etrafına dikdörtgen ROI'ler çizerek İlgi Alanları (ROI'ler) çizin (Şekil 2).
   4. Seç, Kopyala ve Yapıştır komutlarını (veya kullanılan görüntüleme yazılımına bağlı olarak karşılık gelen komutları) kullanarak, ROI'lerin her şeritte aynı alanlarda sinyali ölçtüğünden emin olmak için diğer şeritler içinde aynı ROI'leri çizin. Boşluk olarak kullanılmak üzere kullanılmayan bir şeritten ROI'leri dahil edin.
   5. Analizi Kullanma | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi | Görüntüleme yazılımının komutlarını ekleyin, PEI selüloz plaka üzerine çizilen tüm ROI'leri seçin.
   6. Analizi Kullanma | Set Ölçümleri | Komutları ölçün, her bir ROI içindeki sinyal yoğunluğunu ölçün ve ölçümleri bir elektronik tablo olarak dışa aktarın (Şekil 2). Deneysel sinyallerden boş ROI değerlerini çıkarın.
      
   7. Aşağıdaki formülleri kullanarak her şeritteki karartılmış sinyalin yüzde kaçının ATP ve ppGpp'ye atfedilebileceğini hesaplayın.
      NOT: ROI'ler, fosfor görüntüleyici ile uyumlu ticari yazılım veya ücretsiz olarak kullanılabilen ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri) kullanılarak çizilebilir ve ölçülebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: TLC plakalarının hazırlanması. (A) Plakalar, alt kenarı suya (mavi) yerleştirilerek tek boyutta yıkanır. Kirleticiler (sarı) çözücü ile plakanın üstüne göç eder. (B) Bir plaka tamamen kurutulduktan sonra, ilk yıkamaya göre 90° döndürülerek ve tekrar suyun plakanın üstüne geçmesine izin verilerek ikinci bir boyutta yıkanır. (C) Yıkandıktan sonra, herhangi bir kirletici madde plakanın bir köşesin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnce tabaka kromatograf (TLC) geliştirme tankı	Genel Cam Üfleme Şirketi	80-3
Polyester destekli polietilenimin (PEI)-selüloz plakalar (20 cm x 20 cm, 100 μm kalınlık)	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml kurşun, 100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
Adenozin 5'-trifosfat (ATP) 100 mM	Biyo Temel Kanada	AB0311
Guanozin-5'-difosfat disodyum tuzu (GDP)	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
Depolama fosfor ekranı	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	BAS-IP TR 2040 E Trityum Ekran
Fırtına 860 fosfor görüntüleyici	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	-