1. Kolesterol, fosfolipidler ve sfingomyelin dahil olmak üzere çeşitli lipidlerin miktarını yarı ölçmek için yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC)
- Aşağıdaki dört çalışma solüsyonunu ve boyama solüsyonunu hazırlayın.
- Çözüm 1: Etil asetat (% 26.6), 1-propanol (% 26.6), kloroform (% 26.6), metanol (% 26.6) ve potasyum klorür (% 9.6) karıştırın. 0.25 g KCl'yi 100 mL HPLC kalitesinde suda çözerek KCl'yi hazırlayın.
- Çözüm 2: N-heksan (% 73), dietil eter (% 23) ve sitrik asidi (% 2) karıştırın.
- Çözüm 3: %100 n-hekzan.
- Damıtılmış suyu (90 mL) 7.5 g bakır sülfat ile karıştırarak boyama çözeltisini hazırlayın ve ardından 10 mL fosforik asit ekleyin.
- Her çözeltiden 5 mm'ye kadar ayrı bir cam hazneye doldurun. Her haznedeki çalışma hızını artırmak için herhangi bir filtre kağıdı ekleyin.
- 20 x 10 cm'lik bir HPTLC silika jel 60 cam plakayı, çalışan çözelti plakanın tepesine ulaşana kadar ilk çalışan çözeltide önceden inkübe edin. Daha sonra 110 °C'de 10 dakika kurutun.
not: Bu plakalar ileride kullanılmak üzere alüminyum folyoda saklanabilir ve kullanımdan önce 110 °C'de 10 dakika kurutulabilir.
- İnsan periferik kanından türetilen nötrofillerden elde edilen bir lipit peletini 200 μL kloroform/metanol (1:1) çözeltisi içinde çözün ve çözünmesi için 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
- İstenen sayıda numune ve en az bir standart için yükleme noktalarını işaretlemek için bir cetvel ve yumuşak bir kalem kullanın. Birinci ve ikinci koşu çözümü için koşu mesafesini sırasıyla yaklaşık 4 cm ve 6 cm olarak işaretleyin.
- Numuneleri yüklemek için, her yeni numuneyi yüklemeden önce 10 μL'lik şırıngayı 3 kez kloroform/metanol (1:1) içinde yıkayın. Her numuneden 10 μL'yi damla damla yükleyin ve numuneyi mümkün olduğunca küçük bir alana konsantre etmeye çalışın. Numuneler en azından iki kopya halinde yüklenmelidir.
- Plakayı, çalışan çözelti 1 (adım 1.1.1) ile ilk hazneye dikey olarak yerleştirin. Düzgün bir migrasyon hızı elde etmek için plakanın cam haznenin duvarına paralel olduğundan emin olun.
- Çözücü hattı ilk işarete ulaştığında, plakayı çıkarın, kurutun ve ikinci çözeltiye yerleştirin. İkinci ve üçüncü çalışan çözümler için benzer adımları tekrarlayın; Çözücü önü plakanın üst kısmına ulaşana kadar plakayı solüsyonda bırakın, ardından çıkarın ve RT'de 1 dakika kurutun.
- Plakayı 7 saniye bakır sülfat çözeltisine koyun. Plakayı çıkarın, iyice kurulayın ve 170 °C'de 7 dakika fırında pişirin. Plakanın soğumasını bekleyin.
- İnce tabaka kromatografisi ve jel analiz yazılımının yanı sıra bir görüntü işleme yazılımı kullanarak, çözülmüş lipit bantlarını tanımlamak için tarayın ve analiz edin.
