Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Fare Akciğer Dokusundan İzole Edilen Değişen Zincir Uzunluklarına Sahip Heparan Sülfatları Tespit Etmek İçin Analitik Bir Teknik

Özet

Kaynak: LaRiviere, W. B. ve diğerleri, Poliakrilamid Jel Elektroforezi ve Gümüş Boyama ile Glikozaminoglikanların Tespiti. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak fare akciğer dokusundan izole edilen heparan sülfatların ayırma prosedürünü göstermektedir.

Protokol

1. İzole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminoglikanların poliakrilamid jel elektroforezi

1. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) için gerekli çözeltileri önceden hazırlayın (Tablo 1).
   not: Numunede olması beklenen glikozaminoglikanların boyutuna bağlı olarak çözülen jel çözeltisinin yüzde akrilamidini seçin. Daha büyük parçaların çözülmesi için% 15 önerilir (uzunluk olarak 30'dan fazla disakkarit alt birimi); Daha küçük fragmanlar için %22 (<20 disakkarit alt birimi uzunluğunda).
2. Boş kaseti PAGE tankına yerleştirin. Çözücü jeli aşağıdaki gibi dökün: 15 mL'lik tüpte, 10 mL çözünen jel çözeltisi, 60 μL% 10 amonyum persülfat (taze hazırlanmış olmalıdır) ve 10 μL TEMED'i (en son TEMED'i ekleyin) karıştırın. Tüpü nazikçe 2-3 kez ters çevirin. Yukarıdaki 10 mL'lik çözeltiyi kasete hızlı bir şekilde eklemek için pipet kullanın. 2 mL deiyonize edilmiş, filtrelenmiş su ile kaplayın ve çözünen jelin 30 dakika polimerize olmasına izin verin.
   not: Aşağıdaki PAGE protokolü, toplam hacmi yaklaşık 12 mL olan 13,3 x 8,7 cm (genişlik x uzunluk) 1,0 mm kalınlığında döküm kasetleri kullanan dikey bir PAGE sistemi için optimize edilmiştir. Diğer kaset sistemleri kullanılabilir ancak son kullanıcı tarafından optimizasyon gerektirebilir.
3. Çözünen jel tamamen polimerize olduktan sonra, üzerine konan suyu atın ve istifleme jelini aşağıdaki gibi boşaltın: 15 mL'lik bir tüpte, 3 mL istifleme jeli solüsyonu, 90 μL% 10 amonyum persülfat (taze hazırlanmış olmalıdır), 3 μL TEMED (en son TEMED'i ekleyin).
4. Tüpü nazikçe 2-3 kez ters çevirin. İstifleme jeli solüsyonunu katılaşmış çözünen jelin üzerine hızlı bir şekilde eklemek için bir pipet kullanın; Kaseti ağzına kadar doldurun. Kurulumla birlikte verilen tarağı tam olarak yerleştirin. İstifleme jelinin 30 dakika polimerize olmasına izin verin.
5. Jel polimerize olduktan sonra, bant şeridinin kasetin altından çıkarıldığından emin olun ve kaseti tekrar PAGE tank tertibatına yerleştirin.
6. Üst ve alt hazneleri sırasıyla üst ve alt hazne tamponu ile doldurun.
7. Adım 1.11.4'ten itibaren kurutulmuş numuneleri, gerekli minimum hacimde deiyonize edilmiş, filtrelenmiş suda (PAGE jelindeki kuyucukların hacminin en fazla% 50'si) çözün. Örnek yükleme tamponu ile 1:1 oranında karıştırın. Numuneleri ve HS oligosakkarit "merdivenlerini" (bakınız Tablo 1) jele yükleyin.
8. Jeli 100 V'ta 5 dakika önceden çalıştırın. Daha sonra jeli 200 V'ta 20-25 dakika (%15 poliakrilamid çözünen jel için), 40-50 dakika (%18 poliakrilamid çözünen jel için), 90-100 dakika (%22 poliakrilamid çözünen jel için) çalıştırın.
   not: 200 V çalışma süresinin bir miktar optimizasyonu gerekli olabilir. Fenol kırmızısı, uzunluğu 2 polimer alt birimi olan heparin oligosakkaritlerinin önüne geçer (yani, polimerizasyon derecesi 2 veya dp2); Bromofenol mavisi, DP10-DP14'ün önüne geçer. En iyi sonuçlar, fenol kırmızı bandının neredeyse ama tam olarak değil, jelin dibine göç edeceği şekilde voltaj uygulandığında elde edilir. Çalışma süresini buna göre ayarlayın.

Sonuçlar

Tablo 1: Saflaştırılmış glikozaminoglikanların poliakrilamid jel elektroforezi için gerekli çözeltiler. Kullanmadan önce tüm çözeltiler filtrelenmelidir (0.22 μm).

NOT: Kullanmadan önce tüm solüsyonlar filtrelenmelidir (0.22μm).
çözüm	yemek tarifi	kompozisyon

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amonyum persülfat (katı)	ThermoFisher Bilimsel	BP179-25	Elektroforez sınıfı
Barnstead GenPure Pro Su Arıtma Sistemi	ThermoFisher Bilimsel	10-451-217 PAKET	Herhangi bir su deiyonize / arıtma sistemi kabul edilebilir bir alternatiftir
Borik asit (katı)	ThermoFisher Bilimsel	A73-500	Moleküler biyoloji notu
Bromfenol mavisi (katı)	ThermoFisher Bilimsel	B392-5
PAGE için kriter boş kaset (1,0 mm kalınlığında, 12+2 kuyu)	Biyo-Rad	3459901	1.0 mm kalınlığındaki herhangi bir PAGE döküm kaset sistemi yeterli olacaktır
Kriter SAYFASI Hücre sistemi (hücre ve güç kaynağı)	Biyo-Rad	1656019	Karşılaştırılabilir herhangi bir dikey jel PAGE sistemi çalışacaktır)
EDTA disodyum tuzu (katı)	ThermoFisher Bilimsel	02-002-786	Moleküler biyoloji notu
Glisin (katı)	ThermoFisher Bilimsel	G48-500	Elektroforez sınıfı
Hidroklorik asit (sıvı)	ThermoFisher Bilimsel	A466-250
N,N'-metilen-bis-akrilamid (katı)	ThermoFisher Bilimsel	BP171-25	Elektroforez sınıfı
Fenol kırmızısı (katı)	ThermoFisher Bilimsel	P74-10 Serisi	Serbest asit
Sükroz (katı)	ThermoFisher Bilimsel	BP220-1	Moleküler biyoloji notu
TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiamin)	ThermoFisher Bilimsel	BP150-20	Elektroforez sınıfı
Tris tabanı (katı)	ThermoFisher Bilimsel	BP152-500	Moleküler biyoloji notu
Vakum filtre ünitesi, tek kullanımlık, 0.22uM gözenekli PES, 500mL hacim	ThermoFisher Bilimsel	569-0020	Alternatif hacimler ve filtre malzemeleri kabul edilebilir
Akrilamid (katı)	ThermoFisher Bilimsel	BP170-100	Elektroforez sınıfı
Heparin türevi dekaskarit (dp10)	Galen bilimsel	HO10
Heparin türevi hekzasakkar (dp6)	Galen bilimsel	HO06
Heparin türevi oligosakkarit (dp20)	Galen bilimsel	HO20

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi