Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Sultana, S. et al. Escherichia coli'nin Proteotoksik Stres Etkeni ile Tedavi Edildikten Sonra Protein Agregatlarının Ekstraksiyonu ve Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protokol

1. Ekstrakte edilmiş protein agregatlarının SDS-PAGE kullanılarak ayrılması ve görselleştirilmesi

1. %12 SDS-poliakrilamid jel hazırlayın
   1. İki ayırıcı jel için, 5.1 mL çift damıtılmış su (ddH₂O), 3.75 mL Tris-HCl (pH 8.8), 7.5 mL %20 (a/h) SDS, 6 mL %30 akrilamid/bisakrilamid (29:1) solüsyonu, 75 mL %10 w/v amonyum persülfat ve 10 mL tetrametiletilendiamin (TEMED) pipetleyin ve hava kabarcıkları oluşturmadan hafifçe karıştırın. Jeli cam plakaların içine 1 mL'lik bir pipet kullanarak dökün ve üst 2 cm'yi karışımdan arındırın. Ayırma jelinin üstüne %70 etanol ekleyin ve iki katman arasında eşit bir arayüz sağlayın.
   2. Ayırma jelinin polimerizasyonundan sonra, 1.535 mL ddH₂O, 625 mL Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mL %20 (a/h) SDS, 335 mL %30 akrilamid/bisakrilamid (29:1) çözeltisi, 12.5 mL %10 w/v amonyum persülfat ve 2.5 mL TEMED pipetleyerek istifleme jelini hazırlayın. Etanolü ayırma jellerinden çıkarın ve istifleme jeli çözeltisini ekleyin. Hava kabarcıkları oluşturmadan istenen sayıda cebe sahip bir tarak yerleştirin. 20-30 dakika polimerizasyona izin verin.
2. Her numuneden ve protein merdiveninden 4 μL'yi ayrı kuyucuklara yükleyin ve jelleri Tris-Glisin çalışma tamponunda (Tablo 1) oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 144 V'ta çalıştırın.
   not: Bromofenol bandı jelden dışarı çıkmak üzereyken jeli durdurun.
3. Jel(ler)i önceden ısıtılmış bir Fairbanks çözeltisi A'da (Tablo 1) bir külbütör üzerinde 30 dakika boyunca boyayın.
4. Jel(ler)in rengini önceden ısıtılmış bir Fairbanks çözeltisi D'de (Tablo 1) bir külbütör üzerinde istenen arka plana (örn. gece boyunca) kadar çıkarın.

Sonuçlar

Çözümleri	Tarifler
Tampon A	10 mM potasyum fosfat (pH 6.5), 1 mM EDTA
Tampon B	% 2 Nonidet P-40 içeren tampon A. Daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında saklanabilir.
Fairbanks A (Boyama solüsyonu)	%25 izopropanol, %10 Buzlu Asetik asit, 1,4 g Coomassie R-250

...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kimyasallar/Reaktifler
aseton	Balıkçı Bilimsel	67-64-1
%30 Akrilamid/Bisakrilamid çözeltisi 29:1	Biyo-Rad	1610156
Amonyum persülfat	Kırlangıç Sigma	A3678-100G
Bluestain 2 Protein merdiveni, 5-245 kDa	Altın Biyografi	P008-500 Serisi
β-merkaptoetanol	Kırlangıç Sigma	M6250-100ML
Bromofenol mavisi	Altın Biyografi	B-092-25
Coomassie Parlak Mavi R-250	MP Biyomedikal LLC	821616
Etilendiamin tetra asetik asit (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Buzul Asetik asit	Kırlangıç Sigma	ARK2183-1L
Gliserol, %99	Sigma-Aldrich	G5516-1L
glisin	Altın Biyografi	G-630-1
İzopropanol (2-Propanol)	Sigma	402893-2.5L
10x MOPS Tamponu	Teknova Belediyesi	M2101
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetrametiletilendiamin (TEMED)	Kırlangıç Sigma	T9281-50ML
Tris tabanı	Altın Biyografi	T-400-1
Malzeme/Ekipman
güç kaynağı	ThermoFisher Bilimsel	EC105
Rocker	Alkali Bilimsel	RS7235
Küçük cam tabak	Biyo-Rad	1653311
Ara plakalar (1 mm)	Biyo-Rad	1653308
Spektrofotometre	Termo Bilimsel	3339053
15 mL santrifüj tüpleri için masa üstü santrifüj	Beckman-Coulter
Dikey jel elektroforez odası	Biyo-Rad	1658004
Girdap	Balıkçı Girdabı Cin 2	12-812
Termo karıştırıcı	Kıyaslama Bilimsel	H5000-HC
10 kuyulu tarak	Biyo-Rad	1653359

Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi · arası Serisi