RNA Analizi için Üre Poliakrilamid Jel Elektroforezinin Denatüre Edilmesi: Floresan Etiketli Fosforile RNA Oligonükleotidlerini Fosforile Olmayan Eşdeğerlerinden Ayırmak İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Pillon, MC, et al., Küçük Nükleotid Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunu Ölçmek için Radyoaktif Olmayan Deney. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, fosforile RNA türlerinin fosforile olmayan muadillerinden ayrılması için denatüre edici bir poliakrilamid jel elektroforezi gösteriyoruz. RNA türleri, jel üzerinde lazer tespiti için floresan olarak etiketlenmiştir.

Protokol

1. Jel elektroforezi

1. % 15 akrilamid/8 M üre jel çözeltisi hazırlayın.
   Dikkat: Akrilamit bir nörotoksin olduğu için dikkatli kullanılmalıdır. Kullanırken daima eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük takın.
   1. 150 mL'lik bir cam beherde, 22.5 mL önceden karıştırılmış %40 akrilamid / bis-akrilamid 29: 1 çözeltisi, 6 mL 10x TBE, 28.8 g üre ve RNaz içermeyen suyu toplam 59 mL hacme birleştirin. Çözeltiyi yavaşça karıştırın.
      not: RNA substrat uzunluğuna bağlı olarak, poliakrilamid yüzdesini değiştirmek, fosforile edilmemiş ve fosforile edilmiş RNA arasındaki çözünürlüğü iyileştirebilir.

Sonuçlar

Figure 1: Fosforile RNA'nın denatüre edici jel analizi örneği. 500 nM SC-ITS2 RNA ile inkübe edilmiş Las1-Grc3'ün (110 nM) in vitro RNA kinaz testi. X, Las1-Grc3 olmadan kontrol reaksiyonunu işaretler ve siyah üçgen, ATP'nin 0-10 mM arasındaki titrasyonunu temsil eder. C2 RNA, Las1 nükl.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,4 mm 34 oyuklu tarak	BioRad (BiyoRad	1653848
0,4 mm ara parçası	BioRad (BiyoRad	1653812
0,5 M EDTA ph 8.0	KD Medikal	RGF-3130
1M Magnezyum Klorür	KD Medikal	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Medikal	RGF-3360
%40 Akrilamid/Bis Çözeltisi 29:1	BioRad (BiyoRad	1610146
5M Sodyum Klorür	KD Medikal	RGF-3720
amonyum persülfat (APS)	BioRad (BiyoRad	161-0700
Atp	Sigma	A2383-1G
borik asit	Sigma	B0394
Bromofenol Mavi Sodyum Tuzu	Sigma	B5525-5G
Cam Tabaklar	Thomas Bilimsel	1188K51
Hoefer SQ3 Sıralayıcı	Hoefer Fabrikası	Yok
Image J Yazılımı	Yok	Yok	https://imagej.nih.gov/ij/
Etiketli RNA oligonükleotidleri	Kimlik Bilgisi	Özel Sipariş
Pharmacia EPS 3500 Güç Kaynağı	Eczacılık	Yok
Steriflip 0.22 um Filtre	Kırlangıç	5FCP00525
TEMED (TEMED)	BioRad (BiyoRad	161-0800
TRIS tabanı	Sigma	TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 jel görüntüleyici	GE Sağlık	Yok
Ultra Saf DEPC Su	Canlandırıcı	750023
Ultra Saf Gliserol	Canlandırıcı	19E1056865
üre	Fisher Kimya	U15-500

) ) Serisi Serisi Serisi ) Serisi ) Serisi Serisi ) (Türkçe) Serisi