RNA Analizi için Üre Poliakrilamid Jel Elektroforezinin Denatüre Edilmesi: Floresan Etiketli Fosforile RNA Oligonükleotidlerini Fosforile Olmayan Eşdeğerlerinden Ayırmak İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Pillon, MC, et al., Küçük Nükleotid Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunu Ölçmek için Radyoaktif Olmayan Deney. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, fosforile RNA türlerinin fosforile olmayan muadillerinden ayrılması için denatüre edici bir poliakrilamid jel elektroforezi gösteriyoruz. RNA türleri, jel üzerinde lazer tespiti için floresan olarak etiketlenmiştir.

Protokol

1. Jel elektroforezi

1. % 15 akrilamid/8 M üre jel çözeltisi hazırlayın.
   Dikkat: Akrilamit bir nörotoksin olduğu için dikkatli kullanılmalıdır. Kullanırken daima eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük takın.
   1. 150 mL'lik bir cam beherde, 22.5 mL önceden karıştırılmış %40 akrilamid / bis-akrilamid 29: 1 çözeltisi, 6 mL 10x TBE, 28.8 g üre ve RNaz içermeyen suyu toplam 59 mL hacme birleştirin. Çözeltiyi yavaşça karıştırın.
      not: RNA substrat uzunluğuna bağlı olarak, poliakrilamid yüzdesini değiştirmek, fosforile edilmemiş ve fosforile edilmiş RNA arasındaki çözünürlüğü iyileştirebilir.
   2. Üreyi çözmek için, çözeltiyi mikrodalgada 20 saniye ısıtın, sıvıyı karıştırın ve çözeltiyi hemen 20 saniye daha mikrodalgaya geri koyun. Üre tamamen eriyene kadar çözeltiyi yavaşça karıştırın.
   3. Cam kabı soğuk su içeren sığ bir su banyosuna yerleştirerek çözeltiyi yavaşça soğutun. Cam kabı çevreleyen soğuk su seviyesinin, cam kabının içindeki çözelti seviyesinin üzerinde olduğundan emin olun. Bu, verimli ısı transferini teşvik edecektir. 5 dk.
      bekleyin not: Cam kabı ısınıyorsa bu protokole devam etmeyin; su 25 °C'nin altında olmalıdır. 5 dakika sonra hala sıcak geliyorsa, su banyosundaki suyu taze soğuk suyla değiştirin ve 5 dakika daha bekleyin.
   4. Partikülleri ve mikroskobik hava kabarcıklarını gidermek için 0,22 μm tek kullanımlık filtreleme ünitesi kullanarak çözeltiyi filtreleyin ve gazını alın.
2. Denatüre edici jeli dökün
   1. Toplam boyutları 31,0 cm x 38,5 cm olan jeller için tasarlanmış kısa ve uzun bir cam plakayı temizlemek için sabun ve ılık su kullanın. Her cam plakaya% 95 etanol püskürtün ve nemi gidermek için camı silin><. not: Cam plakalı sandviçi ayırırken jelin zarar görmesini önlemek için iki plakadan biri silikonlanabilir. Bununla birlikte, bu adım gerekli değildir, çünkü bu protokol cam plakaları ayırmadan RNA'yı görselleştirmek için tasarlanmıştır.
   2. Uzun cam plakayı, tezgah üstünden yükseltilecek şekilde bir kutunun üzerine yatay olarak yerleştirin.
      Dikkat: Akrilamid toksiktir, bu nedenle jel dökme istasyonu, dökülen herhangi bir sıvıyı emebilen tezgah kağıdı ile kaplanmalı ve işlem tamamlandıktan hemen sonra bir atık torbasına yerleştirilmelidir.
   3. Uzun cam plakanın uzun kenarları boyunca 0,4 mm'lik temiz bir ara parça yerleştirin.
   4. Kısa cam plakayı uzun plakanın üzerine yerleştirin ve kısa plakanın, uzun plakanın ve ara parçaların kenarlarının hizalandığından emin olun. Kelepçe her iki tarafı da eşit aralıklı üç metal kelepçe kullanarak sıkıştırın.
   5. Adım 3.1'de hazırlanan %15 akrilamid/8 M üre çözeltisine 24 μL TEMED ekleyin ve çözeltiyi karıştırın.
   6. Adım 1.2.5'teki çözeltiye 600 μL %10 (a/h) APS ekleyin ve çözeltiyi yavaşça karıştırın.
   7. Çözeltiyi hemen cam plakalar arasına dökün.
      not: Kabarcıkları önlemek için, çözelti dökülürken cama hafifçe vurun.
   8. Cam plakalı sandviçin üstüne dikkatlice temiz, 0,4 mm, 32 kuyulu bir tarak ekleyin.
   9. Akrilamidin polimerize olması için en az 30 dakika bekleyin.
3. Denatüre edici jeli çalıştırın
   1. Isı bloğunu 75 °C'ye ayarlayın.
   2. Cam plakalı sandviçi bir arada tutan metal kelepçeleri çıkarın ve cam plakalı sandviçi iyice yıkayın ve kurulayın.
   3. Cam plakalı sandviçi, kısa plaka içe bakacak şekilde jel aparatına yerleştirin.
   4. 100 mL 10x TBE ile 1,9 L RNaz içermeyen suyu birleştirerek 0,5x TBE çalışma tamponu hazırlayın. Jel aparatının üst ve alt bölmelerine 600 mL çalışan tampon ekleyin.
   5. Tarağı yavaşça çıkarın ve bir şırınga kullanarak kuyuları iyice durulayın. NOT: Bu adım, kuyulardan ürenin uzaklaştırılması için kritik öneme sahiptir.
   6. Jeli 50 W'ta 30 dakika önceden çalıştırın. Voltaj yaklaşık 2.000 V'tur. DİKKAT: Bu jel aparatı yüksek watt değerinde çalışır ve kullanıcılar önlem almalıdır.
   7. Bir şırınga kullanarak kuyuları iyice durulayın.
      not: Bu adım, numunenin kuyucuklara eşit şekilde yüklenmesi için kritik öneme sahiptir.
   8. Nabız dönüşü, söndürülmüş reaksiyonlar. Daha sonra tüpleri 75 °C'de 3 dakika inkübe edin. Nabız dönüşünü tekrarlayın.
   9. Hemen kuyucuk başına 10 μL numune yükleyin ve jeli 50 W.
      'de 3 saat çalıştırın not: Floresan etiketli RNA ışığa duyarlıdır; Bu nedenle jel aparatını folyo ile örtün.
4. Denatüre edici jeli görüntüleyin.
   1. Güç kaynağını kapatın ve jel aparatının üst haznesini boşaltın.
   2. Cam plakalı sandviçin dış tarafını sabun ve su kullanarak yıkayın ve kurulayın. Jeli taşırken cam plakalı sandviçi folyo ile örtün.
   3. Cam plakalı sandviçi, kantitatif ve hassas floresan algılama yeteneğine sahip bir lazer tarayıcının sahnesine monte edin.
      not: Bu jel, maksimum çözünürlük için son derece incedir. Bu nedenle, bu protokol, floresan etiketli RNA'yı cam plakalar aracılığıyla doğrudan görselleştirerek jeli cam plaka sandviçinden çıkarmanın zorluklarını önlemek için tasarlanmıştır. Piyasada bulunan düşük floresan cam plakaların kullanılması, sinyal-gürültü oranını iyileştirerek yakalanan sinyali artıracaktır.
   4. İstenen florofor için lazer tarayıcının uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın.
      not: Optimum uyarma ve emisyon dalga boyları, belirli floroforlar için farklılık gösterebilir. FAM florofor için, uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 495 nm ve 535 nm'dir.
   5. Lazer tarayıcı aşamasında görselleştirilecek alanı tanımlayın ve jeli üreticinin talimatlarına göre görüntüleyin (Şekil 1).

Sonuçlar

Figure 1: Fosforile RNA'nın denatüre edici jel analizi örneği. 500 nM SC-ITS2 RNA ile inkübe edilmiş Las1-Grc3'ün (110 nM) in vitro RNA kinaz testi. X, Las1-Grc3 olmadan kontrol reaksiyonunu işaretler ve siyah üçgen, ATP'nin 0-10 mM arasındaki titrasyonunu temsil eder. C2 RNA, Las1 nükl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,4 mm 34 oyuklu tarak	BioRad (BiyoRad	1653848
0,4 mm ara parçası	BioRad (BiyoRad	1653812
0,5 M EDTA ph 8.0	KD Medikal	RGF-3130
1M Magnezyum Klorür	KD Medikal	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Medikal	RGF-3360
%40 Akrilamid/Bis Çözeltisi 29:1	BioRad (BiyoRad	1610146
5M Sodyum Klorür	KD Medikal	RGF-3720
amonyum persülfat (APS)	BioRad (BiyoRad	161-0700
Atp	Sigma	A2383-1G
borik asit	Sigma	B0394
Bromofenol Mavi Sodyum Tuzu	Sigma	B5525-5G
Cam Tabaklar	Thomas Bilimsel	1188K51
Hoefer SQ3 Sıralayıcı	Hoefer Fabrikası	Yok
Image J Yazılımı	Yok	Yok	https://imagej.nih.gov/ij/
Etiketli RNA oligonükleotidleri	Kimlik Bilgisi	Özel Sipariş
Pharmacia EPS 3500 Güç Kaynağı	Eczacılık	Yok
Steriflip 0.22 um Filtre	Kırlangıç	5FCP00525
TEMED (TEMED)	BioRad (BiyoRad	161-0800
TRIS tabanı	Sigma	TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 jel görüntüleyici	GE Sağlık	Yok
Ultra Saf DEPC Su	Canlandırıcı	750023
Ultra Saf Gliserol	Canlandırıcı	19E1056865
üre	Fisher Kimya	U15-500

) ) Serisi Serisi Serisi ) Serisi ) Serisi Serisi ) (Türkçe) Serisi