İki Boyutlu Yarı Denatüre Edici Agaroz Jel Elektroforezi: Polimorfik Amiloid Liflerini Boyut Heterojenliğine Göre Ayırmak İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Hanna-Addams, S., et al. Amiloid veya Amiloid Benzeri Liflerin Boyut Heterojenliğini Doğrulamak için İki Boyutlu Yarı Denatüre Edici Deterjan Agaroz Jel Elektroforezinin Kullanımı. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, amiloid liflerinin iki boyutlu yarı denatüre edici deterjan agaroz jel elektroforezi bazlı ayrımını göstermektedir. Teknik, polimorfik amiloid agregatlarını heterojen boyutlarına göre ayırır.

Protokol

1. Örnekleri Hazırlayın

1. %10 fetal sığır serumu ve penisilin-streptomisin içeren 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEM) 10 cm'lik bir doku kültürü kabında HT-29 kolon kanseri hücreleri üreten 2 x 10 6 amiloid üretin. Hücreleri% 5 CO₂ ile 37 ° C'lik bir inkübatörde gece boyunca kültürleyin.
   1. Hücreler% 80 birleşme noktasına geldikten sonra, hücreleri 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. 3 mL Tripsin çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
   2. Hücreler tabaktan tamamen ayrıldıktan sonra, 10 mL kültür ortamı ekleyin ve hücreleri 10 mL'lik bir pipetle 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin. Ortamı aspire edin, hücreleri 5 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin ve bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Tabak: 2 x 10,¹⁰ cm'lik iki tabağın her birinde 6 hücre.
   3. Hücrelerin% 5 CO₂ içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde gece boyunca yapışmasına ve iyileşmesine izin verin. 20 ng/mL Tümör Nekroz Faktörü-Alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetik ve 20 μM pan-kaspaz inhibitörü Z-VAD-FMK ile amiloid oluşumunu indüklemek için bir kaba tedavi uygulayın. Kombinasyon TSZ olarak kısaltılır. Diğer yemeği bir kontrol olarak araçla tedavi edin.
2. Uygun bir süre sonra, genellikle 6 saat, hücre lizatını hasat edin.
   1. Hücreleri plastik bir kazıyıcı ile plakadan kazıyın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için 10 mL'lik bir pipet kullanın. Hücreleri 1.000 x g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin.
   2. 10 mL buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse ederek ve 1.000 x g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyerek hücreleri 2 kez yıkayın. PBS çözeltisini aspire edin.
      not: İşlem burada, hücre peletini sıvı nitrojen içinde dondurarak ve 1 aya kadar ˗80 °C'de saklayarak duraklatılabilir.
   3. Hücre peletini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde 30 dakika boyunca 0.3 mL lizis tamponunda inkübe edin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, tüm hücre lizatıdır.
      not: Numune -20 °C'de birkaç aya kadar saklanarak proses burada duraklatılabilir.
   4. Protein konsantrasyonunu bir Bradford testi ile ölçün. 20 μL 3 μg/μL numune hazırlamak için 4x SDD-AGE yükleme tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

2. Jelleri Hazırlayın ve Çalıştırın

1. Bir cam beherde 200 mL 1x Tris-asetat tamponuna (TAE) 2 g agaroz ekleyin ve agarozu eritmek için bir mikrodalgada ısıtın. % 0.1 SDS'lik bir nihai konsantrasyon için 1 mL% 20 SDS ekleyin. Karıştırmak için dikkatlice döndürün. SDS eklemesinden sonra baloncuk oluşturmamaya dikkat edin.
2. Agaroz solüsyonunu 15 cm x 14 cm'lik bir jel levhaya dökün. Kabarcıkları gidermek için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Üstüne 20 oyuklu bir tarak yerleştirin.
3. Birinci boyut: En sağ şeritte 60 μg tam hücre lizatını pipetleyin. Jeli 60 V'ta yaklaşık 4 saat çalıştırın (boya cephesi jelden yaklaşık 3/4 geçene kadar), çalışan tampon olarak %0.1 SDS içeren TAE'yi kullanın.
4. İkinci boyut: Jeli dikkatlice saat yönünün tersine 90° döndürün (Şekil 1A). Jeli 60 V'ta yaklaşık 4 h.
   çalıştırın not: Genel çalışma koşulu 4 V/cm jel uzunluğudur. Birinci ve ikinci boyutlar için çalışma koşullarının tamamen aynı olması önemlidir.

Sonuçlar

Şekil 1. Deneysel protokol.(A) İki boyutlu yarı denatüre edici deterjan agaroz jel elektroforezinin (2D SDD-AGE) şeması. Numuneyi kırmızı ile etiketlenmiş en sağ şeride yükleyerek başlayın. İlk boyut çalışmasının sonlandırılmasından sonra, jeli saat yönünün tersine 90° döndürün. İkinci boyut elektroforezini çalıştırın. Düz ok, ilk boyut çalışmasının yönünü, noktalı ok, ikinci boyut çalışmasının yönünü g...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Jel Elektroforez Ünitesi	balıkçı	HE99XPRO	Jel koşusu için Appratus.
Tarım	VWR (VWR)	97062-250	Agaroz jeli için.
DMEM (Ömer Çiçeğ	Sigma	D6429	hücre kültürü için
fetal sığır serumu	Sigma	F4135	hücre kültürü için
penicilin-streptomisin	Sigma	P4333 Serisi	hücre kültürü için
Tripsin çözeltisi	Sigma	T4049	hücre kültürü için
Doku kültürü için PBS	Sigma	D8662	hücre kültürü için
rekombinant TNF	Laboratuvarımızda üretilmiştir		nekrotozu indüklemek için. Referans 11'e bakın.
smac-mimetik	Dr. Xiaodong Wang'dan hediye		nekrotozu indüklemek için. Referans 11'e bakın.
ZVAD-FMK	ApexBio (İngilizce	A1902	nekrotozu indüklemek için. Referans 11'e bakın.
Hücre Sayacı	Biyo-Rad	1450102	Model TC20; hücreleri saymak için
Pierce™ BCA Protein Test Kiti	Termo Bilimsel	23225	Hücre lizatlarındaki protein konsantrasyonunu ölçmek için
Hücre kaldırıcı	balıkçı	07-200-364	Hücreleri tabaktan çıkarmak için
Lizis Tamponu (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL gliserol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (isteğe göre proteaz ve fosfat inhibitörleri)
10X TAE (1 L)			48,4 g Tris baz 11.42 mL buzlu asetik asit 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 ila 1 L
4X SDD-AGE yükleme tamponu (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL gliserol 4 mL %20 SDS 0,5 mL %10 bromofenol mavisi 31 mL ddH2O
PBST Yıkama Tamponu (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Ara20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 10 L'ye ddH2O ekleyin

Serisi Serisi Serisi Serisi ) Serisi