Doğal protein komplekslerini ayırmak için Multimer-PAGE: bozulmamış multimerik proteinleri doku lizatından ayırmak için Blue Native-PAGE ve SDS-PAGE'den oluşan hibrit bir ayırma tekniği

Özet

Kaynak: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: Biyolojik Örneklerdeki Protein Komplekslerini Yakalamak ve Çözmek için Bir Yöntem. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, doğal protein komplekslerini doku homojenatlarından ayırmak için multimerik PAGE açıklanmaktadır. Teknik, mavi yerel PAGE ve SDS-PAGE tekniklerinin bir karışımıdır. Ayrılan kompleksler, hücre işleyişindeki rolleri için karakterize edilebilir ve incelenebilir.

Protokol

1. Doku Hazırlama

1. 10 mL 4x BN-PAGE numune tamponu hazırlayın (200 mM Bis (2-hidroksietil) amino-tris (hidroksimetil) metan (Bis-Tris), 200 mM NaCl,% 40 w / v gliserol,% 0.004 Ponceau S, pH 7.2).
   not: Bu stok çözeltisi önceden yapılabilir ve 4 ° C'de saklanabilir.
2. 250 μL 4x numune tamponunu 1x ticari proteaz inhibitörü kokteyli içeren 750 μL dH₂O içinde seyreltin. Girdap yapın ve buz üzerinde soğutun.
3. 1 mL 1x buz gibi BN-PAGE numune tamponunda 20 mg hedef dokuyu 30 vuruş temiz dounce homojenizatör ile homojenize edin.
   not: Bu gösteri deneyi için hedef doku tüm s....

Sonuçlar

Şekil 1: Genel multimer-PAGE akış şeması.
(A) BN-PAGE numune tamponunda homojenizasyon gibi denatüre edici olmayan yöntemler kullanarak doku lizatını hazırlayın. (B) Lizatı BN-PAGE jele pipetleyin, ardından BN-PAGE çalışma tamponunda elektroforez (150 volt) gerçekleştirin. Boya cephesi çözünen jele ~ 2 cm geçene kadar numunenin göç etmesine izin verin. (C) İstifleme.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kimyasal
ε-Aminokaproik asit	Sigma	A2504
Akrilamid	Acros Organik	164855000	zehirli.
Akrilamid/bisakrilamid 37.5:1 (%40 T stok solüsyonu)	BioRad (BiyoRad	161-0148	zehirli.
Amonyum persülfat	Sigma	A3678
Keçiden anti tavşan IgG-HRP	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-2004
Bikinkoninik asit test kiti	Termo Balıkçı	23225
Bis-tris Belediyesi	Sigma	B9754
Sığır serum albümini	Sigma	A9647
Bütanol	Balıkçı Bilimsel	A399-1
Kemilüminesans substrat kiti	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	24078
Coomassie mavisi G-250	Sigma-Aldrich	B0770 Serisi
Sayısallık	Sigma	D141	zehirli.
Dimetil sülfoksit	Balıkçı Bilimsel	D128-1
Ditiobis (süksinimidilpropiyonat)	Termo Bilimsel	22585
Kuru yağsız süt	Laboratuvar Bilimsel	M0841
Gliserol	Sigma	G9012
glisin	Balıkçı Bilimsel	BP381-5
Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Termo Balıkçı	78430
hidroklorik asit	Balıkçı Bilimsel	A144SI-212	Titrasyon için. Kostik.
metanol	Balıkçı Bilimsel	A412-4	PVDF membran aktivasyonu için. Zehirli.
Tavşandan monoklonal anti α-sinüklein IgG	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-7011-R
N, N, N ', N' - tetrametiletilendiamin	Sigma	T9281
N,N'-metilenbisakrilamid	Acros Organik	16479	zehirli.
NP40	Boston Biyo Ürünler	P-872
Polisorbat 20 (ara-20)	Balıkçı Bilimsel	BP337-500
Poliviniliden florür transfer membranları	Termo Bilimsel	88518
Ponceau S	Sigma	P3504 Serisi
Potasyum klorür	Balıkçı Bilimsel	P217-3
Potasyum fosfat monobazik	Sigma	P9791 Serisi
Proteaz inhibitörü kokteyli	Termo Bilimsel	88265
SDS çözeltisi (%10 a/h)	BioRad (BiyoRad	161-0416
Sodyum klorür	Balıkçı Bilimsel	BP358-212
Sodyum dodesil sülfat	Sigma	L37771
Sodyum fosfat monobazik	Balıkçı Bilimsel	BP329-1
Trisin	Sigma	T0377
Tris tabanı	Balıkçı Bilimsel	BP152-500
Tris-HCl (0,5 M tampon, pH 6,8)	BioRad (BiyoRad	161-0799
Tris-HCl (1,5 M tampon, pH 8,8)	BioRad (BiyoRad	161-0798
Alet -leri
GE Imagequant LAS 4000	GE Sağlık	28-9558-10
ImageJ yazılımı NIH
Synergy H1 mikroplaka okuyucu	BioTek
Jel Şekillendirici + Stand	Biyorad
Mikrofüj 22R santrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.
2 mL dounce homojenizatör
Vorteks karıştırıcı	Balıkçı Bilimsel
Ultrasonik doku homojenizatörü	Balıkçı Bilimsel	FB120220

Serisi ) Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi ) Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi ) ) Teknolojisi