Doğal protein komplekslerini ayırmak için Multimer-PAGE: bozulmamış multimerik proteinleri doku lizatından ayırmak için Blue Native-PAGE ve SDS-PAGE'den oluşan hibrit bir ayırma tekniği

Abstract

Kaynak: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: Biyolojik Örneklerdeki Protein Komplekslerini Yakalamak ve Çözmek için Bir Yöntem. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, doğal protein komplekslerini doku homojenatlarından ayırmak için multimerik PAGE açıklanmaktadır. Teknik, mavi yerel PAGE ve SDS-PAGE tekniklerinin bir karışımıdır. Ayrılan kompleksler, hücre işleyişindeki rolleri için karakterize edilebilir ve incelenebilir.

Protocol

1. Doku Hazırlama

1. 10 mL 4x BN-PAGE numune tamponu hazırlayın (200 mM Bis (2-hidroksietil) amino-tris (hidroksimetil) metan (Bis-Tris), 200 mM NaCl,% 40 w / v gliserol,% 0.004 Ponceau S, pH 7.2).
   not: Bu stok çözeltisi önceden yapılabilir ve 4 ° C'de saklanabilir.
2. 250 μL 4x numune tamponunu 1x ticari proteaz inhibitörü kokteyli içeren 750 μL dH₂O içinde seyreltin. Girdap yapın ve buz üzerinde soğutun.
3. 1 mL 1x buz gibi BN-PAGE numune tamponunda 20 mg hedef dokuyu 30 vuruş temiz dounce homojenizatör ile homojenize edin.
   not: Bu gösteri deneyi için hedef doku tüm sıçan beyin dokusudur. Homojenizasyondan sonra numuneler, membran proteinlerinin elektroforezini çözündürmek ve izin vermek için %2 digitonin gibi hafif bir deterjanla muamele edilebilir.
4. Homojenatı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve çözünmeyen hücresel içerikleri peletlemek için 30 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı buz üzerinde temiz bir tüpe boşaltın.
5. Bikinkoninik asit (BCA) veya benzer protein kantitasyon testi kullanarak süpernatan protein konsantrasyonunu ölçmek için üretici talimatlarını izleyin.
6. Homojenat numune(ler)i deterjan içeriyorsa, homojenat solüsyonunu %0,25 Coomassie'ye getirmek için yeterli sulu bir çözelti içinde %5 Coomassie Blue G-250 miktarı ekleyin.

2. BN-SAYFASI

1. 25 mL 20x mavi doğal (BN) elektroforez tampon stoğunu (1.0 M Bis-Tris, 1.0 M trisin, pH 6.8) 500 mL 1x çalışan tampon yapmak için %0.002 Coomassie Blue içeren 475 mL dH₂O'ya seyreltin.
   1. Numuneler deterjan içeriyorsa, bunun yerine %0,02 Coomassie içeren 250 mL 1x çalışma tamponu ve hiç içermeyen 250 mL daha yapın.
2. Tampon(lar)ı 4 °C'ye soğutun.
3. Bir poliakrilamid jel dökme kasetini üretici talimatlarına göre temizleyin ve monte edin.
4. BN poliakrilamid jeli (% 3 T istifleme katmanı,% 6 T çözme katmanı) standart bir tarife göre dökün ve kuyu tarağını yerleştirin.
5. Jeller polimerize olduktan sonra, kaseti dH₂O ile durulayın ve elektroforez aparatını üretici talimatlarına göre monte edin.
6. Kuyu tarağını çıkarın ve kuyuları 1x BN-PAGE çalışma tamponu ile doldurun. Numuneler yüklenene kadar tüm iç hazneyi tamponla doldurmaktan kaçının.
   1. Numuneler deterjan içeriyorsa, kuyucukları %0.02 Coomassie Blue içeren tamponla doldurun.
      NOT: 2.7-2.9 arasındaki adımları 4 °C'de gerçekleştirin.
7. Jel yükleme uçlarını kullanarak, 20 μg protein içeren bir homojenat hacmini istenen kuyucuklara pipetleyin. Kullanılmayan kuyucuklara eşdeğer hacimde 1x BN-PAGE numune tamponu pipetleyin.
   not: Kuyucuklara eklenecek uygun homojenat hacmini hesaplamak için BCA tahlilinden belirlenen protein konsantrasyonunu kullanın.
8. Numuneler yüklendikten sonra, iç hazneyi 1 adet BN-PAGE çalışma tamponu ile doldurun. Jelinin tamamen tampona batırıldığından emin olun. Ardından, dış hazneyi üretici tarafından belirtilen seviyeye kadar 1x çalışma tamponu ile doldurun.
   1. Numuneler deterjan içeriyorsa, iç hazneyi %0,02 Coomassie Blue içeren 1x tamponla ve dış hazneyi boyasız 1x çalışma tamponu ile doldurun.
9. Elektrotları güç kaynağına bağlayın ve jel içindeki proteinleri 150 V'ta, boya bandı çözme katmanına ~2 cm ilerleyene kadar elektroforez. Güç kaynağını durdurun ve bağlantısını kesin.

3. Çapraz bağlama

NOT: Adım 3.1-3.6'yı 4 °C'de gerçekleştirin.

1. Elektroforez aparatını sökün ve jel kasetinin cam panellerini ayırın. İstifleme katmanını çıkarın ve atın.
2. Jeli, boya ön kısmının alt kenarının hemen altından dikkatlice kesin. Bu kesimi mümkün olduğunca pürüzsüz ve düz hale getirmeye özen gösterin ve ardından kullanılmayan jel parçasını atın. Bu, homojenat numunesindeki tüm proteini içerecek olan ~2 cm genişliğinde, yatay bir poliakrilamid jel şeridi bırakacaktır.
3. Jel şeridin kenarları boyunca kullanılmayan kısımları kesin.
4. Şeridi dikkatlice küçük bir kapta 10 mL fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içine yerleştirin ve dengelemek için 30 dakika boyunca nütasyon ile hafifçe karıştırın.
5. Dengelemeden sonra, PBS'yi atın ve başka bir 10 mL ile değiştirin. Dimetil sülfoksit içinde çözünmüş 500 μL 25 mM DSP'yi PBS'ye pipetleyin ve 30 dakika boyunca yukarıdaki gibi (adım 3.4) karıştırmaya devam edin.
6. DSP çözeltisini dökün. Reaksiyona girmemiş DSP'yi söndürmek için% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren 10 mL 0.375 M tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (Tris-HCl), pH 8.8 ekleyin. 15 dakika boyunca nütasyona devam edin.

4. SDS SAYFASI

1. Jel şeridi su verirken, SDS-PAGE jel solüsyonlarını standart yöntemlere göre hazırlayın. Polimerizasyon reaktifleri eklemeyin.
2. Su verme işleminden sonra, ΒΝ jel şeridini oda sıcaklığına getirin ve şeridi yeni bir jel kasete atın.
   1. Bunu yapmak için, jeli dikkatlice alın ve temiz bir jel kaset ara plakasına yerleştirin.
   2. Şeridi, boya ön yüzünün alt kısmı yeni bir kasetin üst kısmına en yakın olacak şekilde yönlendirin (yani, BN-PAGE sırasında en uzağa giden taraf yeni kasetin üst kısmına en yakın olmalıdır; jel şerit önceki yönünden ters çevrilmelidir). Şekil 1'e bakın.
   3. Şeridi, üst kenarı, kapak plakasının üst kenarının olacağı yere eşit olacak şekilde yerleştirin (yani, yeni jelin üst kısmında olacaktır). Boya ön yüzünün cam plakanın yatay kenarlarına paralel olduğundan emin olun.
   4. Eksize edilen şeridin bir tarafını ara duvarlardan birine doğru itin, diğer tarafta jelin dökülmesi ve bir protein standardı veya merdivenin yüklenmesi için yer bırakın.
   5. Jel şeridin alt kenarında pürüzlü veya pürüzlü alanlar varsa, bunları dikkatlice kesin. Varsa, jel dökümü sırasında kabarcıkları hapsedeceklerdir.
   6. Jel şerit doğru şekilde yerleştirildikten sonra, kapak plakasını ara plakanın üzerine yerleştirin. Sıkışan hava kabarcıklarını dışarı itmek için hafif baskı uygulayın.
   7. Jel dökme aparatını üretici talimatlarına göre monte etmeye devam edin.
3. Çözünen jel tamponuna polimerizasyon reaktifleri ekleyin ve serolojik bir pipet kullanarak hazırlanan jel kasetine dökün. İstifleme tabakasına yer bırakmak için jel kasetini, eksize edilen BN-PAGE jel şeridinin ~2 cm altına kadar doldurun.
4. Dökülen jelin üzerine 100 μL bütanol ekleyin ve çözünen tabakanın polimerizasyonu için 30 dakika bekleyin. Bütanol'ü dökün.
5. İstifleme jeli çözeltisine polimerizasyon reaktifleri ekleyin. Serolojik bir pipet kullanarak, jel kasetinde kalan tüm boş alanı doldurmak için istifleme katmanını dökün.
   1. İstifleme tabakası dökülürken jel kasetini, jel şeridin altındaki boşluğu dolduracak ve hava kabarcıkları sıkışmayacak şekilde eğin.
   2. İstifleme jeli tamponu jel şeridin altındaki boş alanı doldururken, jel kasetini kademeli olarak düz bir zemine getirin.
   3. Eksize edilen jel şeridinin yanındaki boş alanı, neredeyse taşana kadar istifleme jeli tamponu ile doldurmaya devam edin.
6. İstifleme tabakasının 30 dk.
   polimerize olmasına izin verin not: Jel polimerize olurken 10x SDS-PAGE çalışma tamponu (250 mM tris (hidroksimetil) aminometan (tris), 1.9 M glisin,% 1 SDS) yapın. Bu ayrıca önceden yapılabilir ve oda sıcaklığında saklanabilir.
7. 1x çalışma tamponu yapmak için 50 mL 10x SDS-PAGE çalışan tampon stoğunu 450 mL dH₂O'ya seyreltin.
8. İstifleme tabakası polimerize olduktan sonra, jel kasetini dökme aparatından çıkarın, dH₂O ile durulayın ve elektroforez aparatını üretici talimatlarına göre monte edin.
9. İç hazneyi 1x SDS-PAGE çalışma tamponu ile tamamen doldurun, ardından dış hazneyi üretici tarafından belirtilen seviyeye kadar doldurun.
10. Eksize edilen jel şeridin yanındaki boşluğu bir moleküler ağırlık merdiveni veya uygun protein standardı ile yükleyin.
11. Elektrotları güç kaynağına takın ve numuneleri 120 V'ta elektroforez edin. Coomassie boyası jelden aktığında, güç kaynağını durdurun ve bağlantısını kesin.
12. Antikor bağlanması ile standart elektroblotlama ve protein tespiti yöntemlerini kullanarak jeli analiz edin.

Results

Şekil 1: Genel multimer-PAGE akış şeması.
(A) BN-PAGE numune tamponunda homojenizasyon gibi denatüre edici olmayan yöntemler kullanarak doku lizatını hazırlayın. (B) Lizatı BN-PAGE jele pipetleyin, ardından BN-PAGE çalışma tamponunda elektroforez (150 volt) gerçekleştirin. Boya cephesi çözünen jele ~ 2 cm geçene kadar numunenin göç etmesine izin verin. (C) İstifleme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kimyasal
ε-Aminokaproik asit	Sigma	A2504
Akrilamid	Acros Organik	164855000	zehirli.
Akrilamid/bisakrilamid 37.5:1 (%40 T stok solüsyonu)	BioRad (BiyoRad	161-0148	zehirli.
Amonyum persülfat	Sigma	A3678
Keçiden anti tavşan IgG-HRP	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-2004
Bikinkoninik asit test kiti	Termo Balıkçı	23225
Bis-tris Belediyesi	Sigma	B9754
Sığır serum albümini	Sigma	A9647
Bütanol	Balıkçı Bilimsel	A399-1
Kemilüminesans substrat kiti	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	24078
Coomassie mavisi G-250	Sigma-Aldrich	B0770 Serisi
Sayısallık	Sigma	D141	zehirli.
Dimetil sülfoksit	Balıkçı Bilimsel	D128-1
Ditiobis (süksinimidilpropiyonat)	Termo Bilimsel	22585
Kuru yağsız süt	Laboratuvar Bilimsel	M0841
Gliserol	Sigma	G9012
glisin	Balıkçı Bilimsel	BP381-5
Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Termo Balıkçı	78430
hidroklorik asit	Balıkçı Bilimsel	A144SI-212	Titrasyon için. Kostik.
metanol	Balıkçı Bilimsel	A412-4	PVDF membran aktivasyonu için. Zehirli.
Tavşandan monoklonal anti α-sinüklein IgG	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-7011-R
N, N, N ', N' - tetrametiletilendiamin	Sigma	T9281
N,N'-metilenbisakrilamid	Acros Organik	16479	zehirli.
NP40	Boston Biyo Ürünler	P-872
Polisorbat 20 (ara-20)	Balıkçı Bilimsel	BP337-500
Poliviniliden florür transfer membranları	Termo Bilimsel	88518
Ponceau S	Sigma	P3504 Serisi
Potasyum klorür	Balıkçı Bilimsel	P217-3
Potasyum fosfat monobazik	Sigma	P9791 Serisi
Proteaz inhibitörü kokteyli	Termo Bilimsel	88265
SDS çözeltisi (%10 a/h)	BioRad (BiyoRad	161-0416
Sodyum klorür	Balıkçı Bilimsel	BP358-212
Sodyum dodesil sülfat	Sigma	L37771
Sodyum fosfat monobazik	Balıkçı Bilimsel	BP329-1
Trisin	Sigma	T0377
Tris tabanı	Balıkçı Bilimsel	BP152-500
Tris-HCl (0,5 M tampon, pH 6,8)	BioRad (BiyoRad	161-0799
Tris-HCl (1,5 M tampon, pH 8,8)	BioRad (BiyoRad	161-0798
Alet -leri
GE Imagequant LAS 4000	GE Sağlık	28-9558-10
ImageJ yazılımı NIH
Synergy H1 mikroplaka okuyucu	BioTek
Jel Şekillendirici + Stand	Biyorad
Mikrofüj 22R santrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.
2 mL dounce homojenizatör
Vorteks karıştırıcı	Balıkçı Bilimsel
Ultrasonik doku homojenizatörü	Balıkçı Bilimsel	FB120220