PCR Sonrası DNA Amplikonlarının Agaroz Jel Elektroforezi: Multipleks PCR Ürünlerini Analiz Etmek ve PCR Reaksiyon Başarısını Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Gulla, S. et al. Çoklu-lokuslu Değişken sayılı Tandem-tekrar Balık Patojenik Bakterisi Yersinia ruckeri'nin Multipleks PCR ve Kılcal Elektroforez ile Analizi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, agaroz jel elektroforezi kullanılarak bakteriyel PCR ile amplifiye edilmiş DNA'nın ayrılmasını gösteriyoruz. Agaroz jel, moleküler bir elek görevi görür ve negatif yüklü DNA'nın uygulanan bir elektrik alanı altında boyutlarına bağlı olarak göç etmesini sağlar.

Protokol

>1. Jel Elektroforezi ile PCR Amplikon Onayı

1. Üreticinin tavsiyelerine göre, test edilecek PCR reaksiyonlarının sayısına uygun 1x tris-borat-EDTA (TBE) tamponunda %1,5 (a/h) agaroz jel hacmi hazırlayın. Dökümden önce, 50 μL jel çözeltisi başına 5 μL floresan nükleik asit boyası ekleyin ve karıştırın. Döküm için uygun tepsileri ve tarakları kullanın ve DNA referans merdivenleri için uygun sayıda kuyuyu boş bırakın.
2. Ayarladıktan sonra, jeli bir GE sisteminde 1x TBE tamponuna batırın. 5 μL PCR ürününü 2 μL yükleme boyası ile karıştırın ve jel kuyularına aktarın. Referans için boş kuyucuklara 5 μL DNA merdiveni ekleyin.
3. Jeli yaklaşık 1 saat boyunca 15 cm'de 110 V'ta çalıştırın ve PCR amplikonlarını temsil eden birden fazla (beşe kadar) bandın varlığını doğrulamak için UV bazlı bir jel görüntüleme/görselleştirme sistemi kullanın (Şekil 1'deki örneğe bakın). Jeli atın. Kalan PCR ürünlerini daha fazla işlenene kadar 4 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Birden fazla PCR ürününün varlığını doğrulayan jel elektroforezi. Görüntü, numune içeren 12 şeridin tümünde birden fazla PCR amplikonunun varlığını doğrulamaktadır ve ilk şerit kullanılan DNA merdivenini temsil etmektedir. Seçilen merdiven parçalarının boyutları, PCR testi ve her şeridin suş bağlantısı gibi belirtilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agaroz, evrensel, peqGOLD	VWR (VWR)	732-2789P/732-2788
Tris-borat-EDTA (TBE) tamponu	Na	Na	Standart tarif; şirket içinde üretilir.
DNA Jel Yükleme Boyası (6X)	Thermo Fisher Bilimsel	R0611
Jel elektroforez sistemi	Tercih edildiği gibi	Na
GelRed Nükleik Asit Lekesi, suda 10.000X	Biyotyum	41003	Floresan nükleik asit boyası
GeneRuler 50 bp DNA Merdiveni, kullanıma hazır	Thermo Fisher Bilimsel	SM0373	DNA merdiveni
UV bazlı jel görüntüleme/görselleştirme sistemi	Tercih edildiği gibi	Na

Serisi Serisi