Kılcal Elektroforez: Floresan Etiketli Polimeraz Zincir Reaksiyonu Amplikonlarını Analiz Etmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Gulla, S. et al., Balık patojenik Bakterisi Yersinia ruckeri'nin Multipleks PCR ve Kılcal Elektroforez ile Çok Lokuslu Değişken Sayılı Tandem Tekrar Analizi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, boyutlarına göre çeşitli örneklerden elde edilen floresan etiketli PCR amplikonları analiz etmek için kılcal elektroforez tekniği açıklanmaktadır. Her parçadaki etiketli floresan boya yardımıyla parçaların baz çifti uzunluklarını belirleyen bir göç modeli oluşturur.

Protokol

1. Kapiler Elektroforez Kurulumu ve Çalışma Koşulları

1. PCR amplikonlarının onaylanmasını takiben, PCR ürünlerini arıtılmış suda 1:10 (h/h) oranında seyreltin. Kısa bir süre kapatın, karıştırın ve santrifüjleyin.
2. Bir çeker ocakta çalışarak, PCR ürünü başına 9 μL formamid ve 0,5 μL boyut standardından oluşan bir ana karışım hacmi hazırlayın (%10 fazla hacme izin verin). 0,5 μL seyreltilmiş PCR ürünü eklemeden önce kısa bir süre girdap yapın ve 9,5 μL'yi mevcut CE sistemine uygun bir plaka üzerindeki kuyucuklara dağıtın. Kısaca kapatın, karıştırın ve santrifüjleyin.
   DİKKAT: Dikkatli tutun. Formamidin su ile karıştırılması, toksik olan formik asit üretir.
3. Bir PCR termal döngüleyici kullanarak, numuneleri süresiz olarak 95 °C'ye soğutmadan önce 3 dakika boyunca 4 °C'de denatüre edin. Kısa bir süre santrifüjleyin ve plakayı üreticinin talimatlarına göre kalibre edilmiş bir CE sistemine yükleyin.
4. Tercih edilen aparat ve aşağıdaki ayarlar için uygun reaktifleri kullanarak parça analizi CE'yi çalıştırın: 60 °C; 1,6 kV'de 5 s enjeksiyon (cm başına 32 V); 15 kV'de 32 dakika çalışma süresi (cm başına 300 V). 24 kılcal (50 cm) bir kilcal damar üzerinde 24 kuyucuğun CE parça analizi tipik olarak yaklaşık 50 dakika sürecektir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Avant 3500xL Genetik Analiz Cihazı	Thermo Fisher Bilimsel	A30469	Kapiler elektroforez fragman analizi için kullanılır.
GelRed Nükleik Asit Lekesi, suda 10.000X	Biyotyum	41003	Jel elektroforezi sırasında kullanılan floresan nükleik asit boyası.
GeneMapper Yazılımı 5	Thermo Fisher Bilimsel	4475073	Kılcal elektroforezden elektroferogramları okumak için kullanılır.
GeneScan 600 LIZ boya Boyutu Standardı v2.0	Thermo Fisher Bilimsel	4408399	Kılcal elektroforez sırasında kullanılan boyut standardı.
Hi-Di Formamid	Thermo Fisher Bilimsel	4311320/4440753	Kapiler elektroforez sırasında kullanılan deiyonize formamid. Çalışma kanallarını hazırlayın.
Milli-Q su	Na	Na	PCR ve kapiler elektroforez sırasında kullanılan arıtılmış su. Standart tarif; şirket içinde üretilir.
3500 Dx/3500xL Dx Genetik Analiz Cihazları için POP-7 Polimer	Thermo Fisher Bilimsel	A26077/4393713/4393709	Kapiler elektroforez sırasında kullanılan ayırma matrisi.
UV bazlı jel görüntüleme/görselleştirme sistemi	Tercih edildiği gibi.	Na
Girdap	Tercih edildiği gibi.	Na

Serisi