Alkali Tek Hücreli Jel Elektroforezi: Kemoterapiyi Takiben Bireysel Kanser Hücrelerinde DNA Hasarının Kantitatif Tahmini için Hassas Bir Teknik

Özet

Kaynak: Lu, Y., et al. Comet Assay J. Vis. Exp. Kullanarak İn Vitro DNA Hasarının Değerlendirilmesi. (2017)

Bu videoda, doksorubisin ile tedavi edilen hücrelerde hem tek hem de çift sarmallı DNA kırılmalarını ölçmek için bir alkalin tek hücreli elektroforez testi gösteriyoruz. Alkali koşullar, DNA baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarını bozarak DNA ipliklerinin tamamen çözülmesine ve ayrılmasına neden olur. Bu, elektroforez üzerine agaroz jel içindeki hasarsız ve hasarlı DNA fragmanlarının diferansiyel göçüne izin vererek, dairesel kuyruklu yıldız kafasını oluşturan yavaşça göç eden hasarsız DNA'nın kuyruklu yıldız şeklindeki bir yapısını ortaya çıkarır ve uzun kuyruklu yıldız kuyruğunu oluşturan hasarlı DNA fragmanlarının hızla göç etmesini sağlar.

Protokol

1. Reaktifleri Hazırlayın

1. 1 adet PBS
   1. 100 mL 10x PBS'yi 900 mL dH₂O ile seyreltin ve bir pH metre kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
2. Lizis çözeltisi (LS)
   1. 900 mL dH 2O'da 2.5 M NaCl, 100 mM disodyum EDTA, 10 mM Tris bazı ve 200 mM NaOH hazırlayın; karışımın tamamen çözünmesine izin vermek genellikleyaklaşık 20 dakika sürer. Bir pH metre kullanarak pH'ı 10'a ayarlayın. % 1 sodyum lauril sarkozinat ve% 1 Triton X-100 ekleyin ve son hacmi 1.000 mL'ye ayarlayın. Kullanmadan önce en az 30 dakika 4°C'ye soğutun.
3. Alkali elektroforez çözeltisi (AES), pH >13
   1. 800 mL dH₂O'da 200 mM NaOH ve 1 mM disodyum EDTA hazırlayın. PH'ı ayarlayın ve pH >13 olduğundan emin olun. Son ses seviyesini 1.000 mL'ye ayarlayın. Kullanmadan önce taze hazırlayın ve kullanmadan önce en az 30 dakika 4°C'ye soğutun
4. Boyama çözeltisi
   1. 1. 30 mL Tris-EDTA tamponuna (10 mM Tris-HCl, 1 mM disodyum EDTA, pH 7.4) 1 μL 10.000x yeşil floresan nükleik asit boyası (örneğin, SYBR Green) ekleyin ve 4 ° C'de saklayın. Işıktan koruyun.
5. % 1 düşük erime noktalı agaroz
   1. % 1 düşük erime noktalı agarozu (100 mL dH₂O'da 1 g) bir mikrodalgada eritin. Agarozun tamamen eridiğinden emin olmak için agarozu her 15-20 saniyede bir döndürün. Agarozu kullanmadan önce en az 20 dakika 37°C su banyosuna koyun.
6. Önceden ısıtılmış pipet uçları
   1. Agarozu pipetlemeden önce P200 pipet uçlarının dar uçlarını 3 mm kesin ve 37°C'de ısıtın.

2. Comet Slaytlarını Hazırlayın

1. Slayt kaplama
   1. % 1 agarozu (100 mL dH₂O'da 1 g) bir mikrodalgada 2-3 dakika veya agaroz tamamen eriyene kadar eritin. Cam mikroskop slaytlarını agarozun içine batırın ve tüy bırakmayan bir mendil kullanarak slaytın bir tarafını silin.
   2. Slaytları havada kuruması veya daha hızlı kuruma için 50 ° C'de ısıtması için düz bir yüzeye koyun; kuruduktan sonra şeffaf bir agaroz filmi oluşturulmalıdır. Kaplamalı slaytları kullanmadan önce 37°C'ye yerleştirin.
2. Tek hücreli süspansiyonların hazırlanması
   1. Glioma hücresini kültürleyin ve tedavi edin
      1. U251 MG hücrelerini% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 10 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM-Ham F-12 ortamında% 5 CO 2 ile 37 ° C'de kültürleyin.
      2. Hücreleri 3 dakika boyunca 1 mL tripsin kullanarak sindirin ve FBS ile DMEM-Ham F-12 ortamı kullanarak tripsini nötralize edin. 15 mL'lik tüpte toplayın, 4 dakika boyunca 300 x g'da döndürün, ortamı aspire edin ve hücreleri 1x PBS'de 2 x 10⁵ hücre / mL'de askıya alın.
         not: Hücre numunesi, teste başlamadan hemen önce hazırlanmalı ve ışıktan kaynaklanan DNA hasarını önlemek için tüm numuneler karanlık veya loş bir ortamda ele alınmalıdır.
      3. Hücre süspansiyonunu 1:10 (h/v) oranında %1 erimiş düşük erime noktalı agaroz (37°C'de) ile birleştirin, yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve hemen 30 μL'yi agaroz kaplı bir lam üzerine pipetleyin. İnce bir tabaka oluşumunu sağlamak için agaroz/hücre karışımını yaymak için pipet ucunun yan tarafını kullanın.
      4. Slaytı karanlıkta 4°C'de 10 dakika düz bir şekilde yerleştirin. Jelleşme süresinin 30 dakikaya çıkarılması, yüksek nemli ortamlarda numunelerin yapışmasını iyileştirir.
      5. Slaytı 4 ° C LS'de 1 saat ila gece boyunca karanlıkta daldırın.
3. Tek Hücre Elektroforezi
   1. Alkali kuyruklu yıldız tahlili için
      1. Slaytları LS'den nazikçe çıkarın, fazla tamponu boşaltın ve DNA'nın çözülmesine izin vermek için 4°C'de 1 saat boyunca AES'ye yavaşça daldırın. Slaytları karanlıkta tutun.
      2. Elektroforez sürgü tepsisine önceden soğutulmuş AES ekleyin, kızakların 0.5 cm'yi aşmayın (bu, elektroforez ünitelerinin boyutuna bağlıdır), kızakları içine yerleştirin ve bir kapakla kapatın. Güç kaynağı voltajını 1 V/cm'ye (elektrotlar arasındaki uzunluk) ayarlayın ve 30°C'de 4 dakika çalıştırın.
      3. Slayttan fazla elektroforez çözeltisini boşaltın. Slaytları oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca iki kez dH₂O'ya yavaşça daldırın.
      4. Slaytları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca nazikçe %70 etanole batırın. Boyamaya devam edin.
4. Leke Kuyruklu Yıldız Slaytları
   1. Slaytları karanlıkta 37°C'de 10 - 15 dakika kurutun.
   2. Her kurutulmuş agarozun üzerine 50 - 100 μL yeşil floresan nükleik asit boyama solüsyonu yerleştirin ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyayın.
   3. Slaytları dH₂O'da kısa bir süre durulayın ve karanlıkta 37°C'de tamamen kurulayın. Görüntü alma ve analizine devam edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10x PBS (Ca ++, Mg ++ ücretsiz)	TEKnova	P0196 Serisi
NaCl (Doğal)	Sigma	S5886 Serisi
Edta	TEKnova	E0308
Trizma tabanı	Sigma	T1503
NaOH (NanoOH	Sigma	72068
Sodyum lauril sarkozinat	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
SYBR Yeşil	Canlandırıcı	S33102 Serisi
Düşük erime noktalı agaroz	Canlandırıcı	16520
agaroz	Canlandırıcı	16500
% 95 etanol	WARNER-GRAHAM	# 64-17-5
Tripsin	GIBCO Bilişim Teknolojileri	25300-054
Cam doku slaytları	ELEKTRON MIKROSKOBU BILIMLERI	63422-11
Kimmendil	KIMberly-Clark
1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri	Denville
Pipet Uçları	keskin
mikrodalga	Avanti
Su banyosu	kesinlik
Yatay elektroforez odası	TREVIGEN (TÜRKÇE)	Cometassay ES II
güç kaynağı	Biyo-Rad
kuvöz	Quincy Laboratuvarı	12-140E Modeli
Floresan mikroskobu	Zeiss	LSM700
Mikropipetleyici	Eppendorf Belediyesi

Teknolojisi Teknolojisi Serisi Serisi ) Serisi Serisi adet Serisi