PCR Ürünlerinin Parça Boyutlandırması için Mikroakışkan Kılcal Elektroforez: DNA Parçalarını Boyuta Göre Ayırmak için Mikroçip Tabanlı Bir Elektroforetik Ayırma Tekniği

Özet

Kaynak: Wang, H., Zhu et al. Frajil X Zeka Geriliği-1 Geninde Sitozin-guanin-guanin Trinükleotid Tekrarlarını Ölçmek İçin Sağlam Bir Polimeraz Zincir Reaksiyonu Tabanlı Test. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, PCR amplikonları boyutlarına göre ayırmak için kullanılan mikroakışkan kılcal elektroforez tekniği açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan boyalar ve standart moleküler boyut belirteçleri kullanılarak parça boyutlandırmaya yardımcı olur.

Protokol

1. PCR Ürünlerinin Parça Boyutlandırması

1. Başlamadan önce, DNA boya konsantresi, DNA jel matrisi, DNA markörü, DNA merdiveni ve saflaştırılmış DNA örneklerinin 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin.
2. Hazırlama istasyonunu ayarlayın
   1. Yeni bir reaktif partisi kullanırken şırıngayı değiştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Taban plakasını ayarlayın ve şırınga klipsinin kolunu serbest bırakın ve en üst konuma kaydırın.
3. Boyutlandırma yazılımını başlatın (Malzeme Tablosuna bakın) ve jel-boya karışımını hazırlayın.
4. Vorteks boya 10 saniye boyunca konsantre olur ve aşağı doğru döner. Bir jel matris şişesine 25 μL boya ekleyin. Karışık çözeltiyi iyice girdaplayın ve aşağı doğru döndürün.
   1. Jel-boya karışımını bir döndürme filtresine aktarın. Sıkma filtresini bir mikrosantrifüje yerleştirin ve oda sıcaklığında 1.500 x g ± %20'de 10 dakika döndürün.
      NOT: Solüsyonu boya ile ışıktan koruyun ve kullandıktan sonra 4 °C'de saklayın. Jel-boya karışımı, hazırlandıktan sonra yaklaşık 15 cips için kullanılabilir. Kullanmadan önce jel-boya karışımının her seferinde 30 dakika oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin.
5. Jel-boya karışımını yükleyin
   1. Hazırlama istasyonuna yeni bir DNA çipi yerleştirin. "G" ile işaretlenmiş kuyucuğa 9 μL jel-boya karışımı ekleyin. Lütfen pistonun 1 mL işaretine yerleştirildiğinden emin olun ve ardından doldurma istasyonunu kapatın.
   2. Şırınga pistonunu klips tarafından tutulana kadar aşağı doğru bastırın. Tam olarak 30 saniye bekleyin ve ardından klipsi bırakın. 5 saniye bekleyin ve ardından pistonu yavaşça 1 mL konumuna geri çekin.
   3. Hazırlama istasyonunu açın ve "G" ile işaretlenmiş kuyucuklara 9 μL jel-boya karışımı ekleyin.
6. Merdiven sembolü ile işaretlenmiş kuyucuğa 5 μL işaretleyici ekleyin ve ayrıca 12 numune kuyucuğunun her birine 5 μL işaretleyici ekleyin. Hiçbir kuyuyu boş bırakmayın.
7. Merdiven sembolü ile işaretlenmiş kuyuya 1 μL DNA merdiveni ekleyin. 12 numune kuyucuğunun her birine 1 μL PCR ürünü (kullanılmış kuyular) veya 1 μL ultra saf su (kullanılmayan kuyular) ekleyin. Çipi yatay olarak girdap karıştırıcı adaptörüne yerleştirin ve belirtilen ayarda (2.400 rpm) 1 dakika boyunca girdap yapın.
8. Çipi biyoanalizör cihazına yerleştirin ve çipi 5 dakika içinde cihazda çalıştırın.
9. Test tamamlandıktan sonra, kullanılmış çipi hemen cihazdan çıkarın.
10. Elektrot temizleyicinin kuyucuklarından birine yavaşça 350 μL deiyonize su ekleyin. Biyoanalizörün kapağını açın ve elektrot temizleyiciyi içine yerleştirin. Kapağı kapatın ve yaklaşık 10 saniye inkübe edin. Kapağı açın ve elektrot temizleyiciyi çıkarın. Elektrotlardaki suyun buharlaşması için 10 saniye daha bekleyin ve ardından kapağı kapatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agilent 2100 Biyoanalizör cihazı: 0.2 mL PCR tüpleri	Aksiyen	PCR-02D-C
Agilent 2100 Biyoanalizör cihazı: 1x TE tamponu, pH 8.0, Rnaz içermez	Ambion Teknolojisi	AM9849
Agilent 2100 Biyoanalizör cihazı: 2100 Biyoanalizör cihazı	Yaşlı	G2939AA
Agilent 2100 Biyoanalizör cihazı: 96 oyuklu PCR Plakası	Termo Balıkçı	AB0800
Agilent 2100 Biyoanalizör cihazı: Elektrot kartuşu	Yaşlı		2100 Biyoanalizör cihazının ekipman malzemeleri
Agilent 2100 Biyoanalizör cihazı: IKA vorteks karıştırıcı	Yaşlı		2100 Biyoanalizör cihazının ekipman malzemeleri
Agilent 2100 Biyoanalizör cihazı: Boyutlandırma yazılımı 2100 Expert yazılımı	Yaşlı		2100 Biyoanalizör cihazının ekipman malzemeleri
Agilent 2100 Biyoanalizör cihazı: Test çipleri	Yaşlı		2100 Biyoanalizör cihazının ekipman malzemeleri
Agilent DNA 7500 kiti	Yaşlı	5067-1506	Parça boyutlandırma için
Agilent DNA 7500 kiti: DNA 7500 Merdiven (sarı kapak)	Yaşlı		Kit içinde: Agilent DNA 7500 kiti (katalog numarası: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kiti: DNA 7500 İşaretleyiciler (yeşil kapak)	Yaşlı		Kit içinde: Agilent DNA 7500 kiti (katalog numarası: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kiti: DNA çipleri	Yaşlı		Kit içinde: Agilent DNA 7500 kiti (katalog numarası: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kiti: DNA Boya Konsantresi (mavi kapak)	Yaşlı		Kit içinde: Agilent DNA 7500 kiti (katalog numarası: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kiti: DNA Jel Matriks Flakon (kırmızı kapak)	Yaşlı		Kit içinde: Agilent DNA 7500 kiti (katalog numarası: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kiti: Elektrot Temizleyici	Yaşlı		Kit içinde: Agilent DNA 7500 kiti (katalog numarası: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kiti: Spin Filtresi	Yaşlı		Agilent DNA 7500 kitinin sarf malzemeleri (katalog numarası: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kiti: Şırınga	Yaşlı		Agilent DNA 7500 kitinin sarf malzemeleri (katalog numarası: 5067-1506)
Talaş hazırlama istasyonu	Yaşlı	5065-4401	2100 Biyoanalizör cihazının ekipman malzemeleri
Filtre plakası vakum Manifoldu: MultiScreenHTS Vakum Manifoldu	Merck Kırlangıç	MSVMHTS00	PCR ürün saflaştırması için Filtre plakası vakum Manifoldu için vakum aleti
Filtre plakası vakum Manifoldu: Silikon tıpa	Merck Kırlangıç	XX2004718	Filtre plakası vakum manifoldu
Filtre plakası vakum Manifoldu: Vakum pompası	Merck Kırlangıç	WP6122050	Filtre plakası vakum manifoldu
Filtre plakası vakum Manifoldu: Atık toplama kabı	Merck Kırlangıç	XX1004705	Filtre plakası vakum manifoldu

Serisi Serisi