$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. İyodoasetamid Kullanarak Serbest Sistein Kalıntılarının Bloke Edilmesi
- U-2 OS hücrelerini 6cm2'lik bir tabakta, %10 fetal sığır serumu ve %1 sodyum piruvat içeren yüksek glikoz içeren minimum esansiyel ortamda% 50 -% 60 birleşmeye kadar büyütün. % 5 CO2'de.
- Kullanmadan hemen önce 10 mM iyodoasetamid stoğu yapın, ardından kullanılmayan reaktifleri atın.
- 0.1 mM nihai konsantrasyon iyodoasetamid doğrudan hücre kültürü ortamına ekleyin. Çanağı oda sıcaklığında 2 dakika hafifçe sallayın.
2. Hücrelerin Hasat Edilmesi
- Medyayı hücrelerden aspire edin.
- Hücreleri 5 mL soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın. Son PBS yıkama solüsyonunu aspire edin, ardından 1 mL soğuk PBS ekleyin.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri tabağın altından kazıyın. 1 mL'lik bir pipet kullanarak PBS'yi ve hücre süspansiyonunu çekin ve tüm sıvıyı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne dağıtın.
- Hücreleri 4 ° C'de üç dakika boyunca 7.500 x g'da döndürün. PBS'yi aspire edin ve hücre peletini geride bırakın. Hücre peleti, işlenene kadar -80 °C'de saklanabilir
3. Proteinin Ekstraksiyonu
- ddH2O içinde seyreltilmiş 1 μL 1x lizis tamponu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Kullanmadan hemen önce 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ekleyin.
- 50 μL 1x lizis tamponunu doğrudan hücre peletine ekleyin ve askıya alın. Bunu 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- % 40'ta sabit darbe modunu kullanarak 8 saniye boyunca sonikat yapın (sonicator için Malzeme Tablosuna bakın; farklı sonikatörler için gerektiği gibi ayarlayın), ekstraktı buz üzerinde tutun.
- Ekstraktı 4 °C'de 5 dakika 16.000 x g'da döndürün. Süpernatant, çözünür protein fraksiyonudur. İstenirse protein konsantrasyonunu belirlemek için Bradford analizi yapılabilir.
4. Numune Hazırlama
- 10 μL çözünür protein ekstraktı alın ve 10 μL 1x Laemmli SDS numune tamponu ekleyin (% 4 SDS,% 20 gliserol,% 0.004 bromofenol mavisi ve 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8). Herhangi bir indirgeyici reaktif eklemeyin.
- O gün SDS PAGE analizi yapılacaksa numuneleri buz üzerinde tutun; uzun süreli depolama için -20 °C uygundur. Jeli çalıştırmadan hemen önce, numuneyi 85 °C'de 5 dakika ısıtın.
5. U-2 OS Hücrelerinde Endojen Proteinlerin İn Vivo Formaldehit Çapraz Bağlanması
- U-2 OS hücrelerini 175cm2'lik bir şişede %70-80 birleşim noktasına kadar büyütün.
- Formaldehit çapraz bağlama reaksiyonunu gerçekleştirin
- Çeker ocakta, ticari kaynaklardan satın alınan %37'lik bir formaldehit çözeltisi bulunur. Formaldehit fiksatifini doğrudan ortama% 1'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.
- Reaksiyonu söndürmek için, 0.125 M'lik bir nihai konsantrasyona 1.25 M glisin ekleyin ve oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde 5 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.
- Hücreleri 5 mL soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Son PBS yıkama solüsyonunu aspire edin ve 10 mL PBS ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak şişenin altındaki hücreleri kazıyın.
- 10 mL'lik bir pipet kullanarak, PBS'yi ve hücre süspansiyonunu çekin ve tüm sıvıyı 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne dağıtın. Hücreleri 4 ° C'de 2 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. PBS'yi aspire edin ve hücre peletini geride bırakın.
6. Çekirdeklerin Parçalanması
- 10 mL homojenizasyon tamponu hazırlayın: 0.25 M sükroz, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES ve pH 7.4'te %0.5 BSA. Kullanmadan hemen önce PMSF'yi 1 mM nihai konsantrasyona ve 3 mL çekirdek süspansiyon tamponuna (PBS'de% 0.1 Triton X-100) ekleyin.
- 5 mL homojenizasyon tamponunu doğrudan hücre peletine ekleyin ve tamamen askıya alın. Süspansiyonu 500 x g'da 2 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın.
- Peleti 5 mL homojenizasyon tamponunda süspanse edin. Sıkı oturan bir cam Teflon homojenizatör kullanın, hücreleri 10 strok/500 rpm'de homojenize edin.
- Süspansiyonu 1,500 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın.
NOT: 10,000 x g'da 10 dakika santrifüjleyerek mitokondrinin izolasyonu için süpernatanı kullanın.
- Peleti 1 mL çekirdek süspansiyon tamponunda askıya alın ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- 10 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Peleti 1 mL çekirdek süspansiyon tamponunda askıya alın ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Son pelet izole edilmiş çekirdekler olacaktır.
7. Proteinin Ekstraksiyonu
- 4. bölümü tekrarlayın, ancak 25 μL'lik 1x lizis tamponunu doğrudan hücre peletine ekleyin ve ardından askıya alın.
8. Numune Hazırlama
- Çözünür protein ekstraktının her biri 10 μL alarak SDS-PAGE için iki numune hazırlayın ve 10 μL 2x Laemmli SDS-numune tamponu ve 1 μL 2-Merkaptoetanol (BME) ekleyin.
- Formaldehit çapraz bağını tersine çevirmek için bir numuneyi 37 °C'de 5 dakika ve ikinci numuneyi 98 °C'de 15 dakika ısıtın.
9. SDS-PAGE Analizi
- 1 L 1x Tris-glisin çalışma tamponu (25 mM Tris, 192 mM Glisin,% 0.1 (a/h) SDS) hazırlayın).
- SDS-PAGE çalıştırma aparatını kurun.
NOT: Bu protokol %16 prekast TGX SDS-Page kullanır. Not, herhangi bir yüzde jel kullanılabilir.
- Üretici protokolüne göre, jelin saklandığı paketi açın ve kaseti çıkarın.
- Kuyucukları kaplayan tarağı ve bandı kasetin altından çıkarın.
- Jeli çalışan aparata yerleştirin.
- Kuyular sıvıya batırılana kadar hazneyi 1x çalışma tamponu ile doldurun. Plastik bir pipet kullanarak, kuyuları çalışan tamponla durulayın.
- Numuneleri 10 μL önceden boyanmış standart işaretleyici ile birlikte jel üzerine yükleyin.
- Boya önü jelin altından yaklaşık 1 cm uzakta olana kadar jeli 200 V'ta çalıştırın.