Sıvı Faz İzoelektrik Odaklama: Biyoaktif Molekülleri Ham Gymnema sylvestre Ekstraktından Ayırmak İçin Bir Elektroforez Tekniği

Özet

Kaynak: Veerapandian, R., et al. Doğal Kaynaklardan Biyoaktif Küçük Moleküllerin, Peptitlerin ve Mikroplardan Proteinlerin Hazırlayıcı İzoelektrik Odaklama (IEF) Yöntemi ile Ayrılması. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, sıvı faz izoelektrik odaklama kullanarak karmaşık molekülleri bitki özlerinden ayırmak için kullanılan bir teknik açıklanmaktadır. Bu teknik, karmaşık biyomoleküllerin doğal hallerinde saflaştırılmasına yardımcı olur ve bu da çeşitli sonraki uygulamalar için kullanılabilir.

Protokol

1. Gymnema sylvestre ekstraktından küçük moleküllerin ve peptitlerin ayrılması ve saflaştırılması

1. 0.6 g bitki ekstraktını ölçün ve damıtılmış suda (60 mL) bir silindir tüp içinde 5 dakika boyunca karıştırarak çözün
   NOT: Çözünür ve tuz içermeyen herhangi bir biyolojik numune, sıvı fazlı bir İzoelektrik Odaklama (IEF) cihazı kullanılarak ayırma ve saflaştırma için kullanılabilir. 10 mM'ye kadar tamponlama tuzu konsantrasyonuna sahip numuneler, biraz azaltılmış çözünürlükle kullanılabilir.
2. Çözünmeyen parçacıkları uzaklaştırmak için çözünmüş bitki ekstraktını 10.000 x g'da 5 dakika
santrifüjleyin.
3. Süpernatanı (~ 60 mL) 80 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 0.6 mL amfolit (pH 3-10) ila% 1 (h / h) ile karıştırın.
4. Sıvı fazlı IEF ünitesini hazırlayın.
   1. Sıvı fazlı IEF elektrotlarını (anot kırmızısı düğme ve katot siyahı düğme) ilgili değişim membranlarıyla kullanım kılavuzuna (Malzeme Tablosu) göre birleştirin. Yeni membranlar kullanıldığında anyon değişim membranlarını 0.1 M NaOH ile ve katyon değişim membranlarını 0.1 M H₃PO₄ ile en az 16 saat dengeleyin.
   2. Membranları çalışmalar arasında elektrolitlerde (0,1 M NaOH veya 0,1 M H₃PO₄) saklayın ve kurumasına izin vermeyin.
   3. İyon değiştirme contalarındaki üç dikdörtgen deliği hizalayarak elektrotun iç ve dış kısmını birleştirin. Membranlarının kurumasını önlemek için elektrotları ilgili elektrolitlerle (~ 25-30 mL) doldurun.
   4. Elektrot içinde basınç oluşturabilecek ve sızıntıya neden olabilecek fazla (elektrot odası hacminin 1/3'ünden fazla) elektrolit eklemeyin.
   5. Numune toplama portlarını, alet montaj parçalarıyla birlikte gelen sızdırmazlık bandı ile kapatın (Malzeme Tablosu). Numune toplama portları tarafı, iki dikey metal hizalama pimi ile tanımlanabilir. Alternatif olarak, bağlantı noktalarını kapatmak için standart sızdırmazlık bandı kullanın.
   6. Odaklama odası tertibatının tüm parçalarını (anot elektrodu, naylon membran çekirdeği, odaklama odası ve katot elektrodu) seramik soğutma parmağı üzerine sırayla monte edin.
   7. 50 mL'lik bir şırınga kullanarak odaklama odasını önceden soğutulmuş damıtılmış suyla (standart IEF hücresi için toplam hacim 60 mL) doldurun.
   8. Sıvı fazlı IEF cihazını 4 ºC'de dolaşan bir soğutma suyuna bağlayın ve üniteyi 15 W ve 3,000 V'ta 3-5 dakika veya voltaj stabilize olana kadar önceden çalıştırın.
      NOT: Genellikle bir dakika içinde voltaj maksimum ayar değerlerine ulaşacaktır. Damıtılmış su ile ön çalıştırma, artık iyonların odaklama odasından ve naylon membran çekirdeğinden uzaklaştırılmasına yardımcı olur.
   9. Güç kaynağını kapatın ve fraksiyon toplayıcıyı kullanarak hücredeki suyu boşaltın. Toplama portlarını sızdırmazlık bandı ile yeniden kapatın. Hazne artık numuneyi yüklemeye hazırdır.
5. 1-1 / 2 inç 19 G künt uçlu iğneli (aletle birlikte gelir) 50 mL'lik bir şırınga kullanın ve hazırlanan numuneyi numune toplama portları aracılığıyla hücreye amfolit (toplam 60 mL) yükleyin.
6. Odaklama hücresini standdan çıkararak ve kabarcıkları çıkarmak için elektrot odasına dokunarak numune hücresindeki hava kabarcıklarını çıkarın. Hava kabarcıklarının varlığı voltaj ve akım dalgalanmalarına neden olacak ve çalışmayı etkileyecektir.
7. Üniteyi su soğutucusuna (4 °C) bağlayın ve güç kaynağı sabit 15 W'ta olacak şekilde fraksiyonlamaya başlayın.
8. Cihazı 3 saat veya voltaj sabit bir değere ulaşana kadar çalıştırın.
   NOT: Numune odaklanmaya başladığında, voltaj sabit bir değere ulaşana kadar kademeli olarak tırmanmaya başlayacaktır.
9. Çalışmadan sonra, IEF ünitesindeki hasat düğmesine AÇIK düğmesine basarak vakum pompasına bağlı hasat kutusundaki (20 adet plastik tüp, 12 mm x 75 mm, 5-6 mL hacim içeren) fraksiyonları toplamaya hazırlanın.
10. 20 toplama pimini, bantla kapatılmış odaklama hücresinin 20 toplama bağlantı noktasıyla hizalayın.
11. Toplama pimlerini sızdırmazlık bandından geçirin ve vakum pompasını aynı anda AÇIK konuma getirin (Şekil 1B, 1C ve 1D).
    NOT: Her odadan yaklaşık 3 mL fraksiyon, her seferinde tüplere toplanacaktır. Fraksiyonlar, sonraki aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir (peptit miktar tayini için SDS-PAGE, küçük moleküller için TLC ve biyo-tahlil).

Sonuçlar

Şekil 1: Sıvı fazlı IEF aparatı kurulumu ve G. sylvestre bitki ekstraktının fraksiyonlanması. (A) Çalışma sırasında, (B) fraksiyon toplama sırasında, (C) fraksiyon toplama işleminden sonra ve (D) sıvı faz IEF aparat parçaları, 1) iyon değişim membranları, 2) odaklama odası ve membran çekirdeği, 3) elektrot tertibatı (negatif), 4) elektrot tertibatı (pozitif).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,45 μm şırınga filtresi	Balıkçı bilim adamı	09-720-004
Bio-Lyte 3/10 Amfolit	Biyo-Rad	163-1113
Bio-Lyte 5/8 Amfolit	Biyo-Rad	163-1192
Kompakt düşük sıcaklık termostatı	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Su soğutmasını 4 ° C'ye ayarlayın ve Rotofor soğutma çekirdeğinden geçtiğinde olduğu gibi 0 ° C'de bile çalıştırılabilir, sirkülasyon suyu sıcaklığı voltaja bağlı olarak yaklaşık 5 veya daha fazla olacaktır.
Gymnema bitki yaprağı özü tozu (%>25 Gymnemik asitler)	Suan Farma, NJ Amerika Birleşik Devletleri
Mini protean elektroforezi	Biyo-Rad
pH metre	Mettler Toledo	S20	Rotofor (sıvı fazlı IEF) fraksiyonlarının pH'ını belirlemek için kullanışlıdır
Rotofor	Biyo-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Ünitenin montajı için Rotofor Kullanım kılavuzu)
RPMI-1640 Orta	HyClone (Klon	DH30255.01
Sızdırmazlık bandı	Biyo-Rad	170-2960	Scotch bant da kullanılabilir
Sorvall legend mikro 17 santrifüj	Termo bilimsel	75002432

Belediyesi ) arası