Hareketlilik Kayması Afinite Kapiler Elektroforezi: Protein-Ligand Komplekslerinin Diferansiyel Migrasyonuna Bağlı Olarak Numune-Ligand Etkileşimlerini Analiz Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Nachbar M. ve diğerleri, AtHIRD11 İçsel Bozukluğun ve Kılcal Jel Elektroforezi ve Afinite Kılcal Elektroforezi ile Metal İyonlarına Bağlanmanın Analizi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, hareketlilik kaymalı afinite kapiler elektroforezi ile protein-ligand etkileşimini analiz etme yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir proteinin çeşitli yüklü ligandlarla bağlanma davranışını karakterize etmek için kullanılabilir.

Protokol

1. ACE analizi için çözeltileri hazırlayın

1. 1 M NaOH çözeltisini hazırlayın.
   1. 100 mL hacimsel bir şişede 4.0 g NaOH tartın.
   2. 1 M'lik bir stok yapmak için işarete kadar deiyonize su ile doldurun.
2. 0.1 M etilendiamintetraasetik asidi (EDTA) 0.1 M NaOH çözeltisi içinde hazırlayın.
   1. 10 mL ampul pipeti kullanarak 100 mL hacimsel bir şişeye 10 mL 0.1 M NaOH aktarın. Deiyonize su ile işarete kadar doldurun.
   2. Bir tartı teknesinde 2,42 g EDTA'yı tartın ve katı bileşiği 100 mL 0,1 M NaOH içinde çözün.
3. Tris tampon (30 mM) çözeltisini hazırlayın.
   1. 500 mL'lik bir behere 3.63 g Tris, 200 mL deiyonize su ve bir karıştırma çubuğu ekleyin. Beheri bir karıştırma plakasına yerleştirin ve açın.
   2. Behere bir pH metre elektrodu yerleştirin ve 0,1 M HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın.
   3. Çözeltiyi 1 L'lik hacimsel bir şişeye doldurun ve işarete kadar deiyonize su ile doldurun.
      NOT: Bu prosedür tekrarlanmalıdır veya tüm analiz için 1 L'den fazla ihtiyaç duyulduğundan daha büyük bir hacimsel şişe gereklidir.
4. Asetanilid elektroozmotik akış (EOF) işaretleyici (60 μM) çözeltisini hazırlayın.
   1. 100 mL hacimsel bir şişeye 6 mg asetanilit ve 100 mL Tris tamponu ekleyin.
   2. Hacimsel şişeyi ultrasonik bir banyoya koyun ve 30 dakika boyunca açın.
5. Numune (1 mg / mL) çözeltisini hazırlayın.
   1. 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü hassas bir teraziye koyun ve tüpe 0,3 mg dondurularak kurutulmuş AtHIRD11 tozu ekleyin.
   2. Tüpe 0,3 mL 30 mM Tris tamponu (pH 7,4) eklemek için bir mikropipet kullanın. Proteini çözmek için tüpü dikkatlice çalkalayın.
6. Ligand çözeltilerini hazırlayın.
   1. CaCl₂ (5 mM) stok çözeltisini hazırlayın.
      1. Bir tartı botu alın, analitik bir teraziye koyun ve 36.76 mg CaCl₂ * H₂O tartın.
      2. Bir mikropipet kullanarak, CaCl₂*H₂O'yu tartı teknesinden önceden hazırlanmış Tris tamponu ile 50 mL'lik hacimsel bir şişeye yıkayın.
      3. Hacimsel şişeyi Tris tamponu ile işarete kadar doldurun.
   2. Kalan stok çözeltilerini hazırlayın (5 mM).
      1. CaCl₂ * H₂O [MgCl₂: 23.80 mg, BaCl₂: 26.02 mg, Sr (NO₃) ₂: 52.91 mg, MnCl₂: 31.46 mg, SeCl₄: 52.91 mg, CoCl₂ * 2H₂O: 41.47 mg, CuCl₂ * 2H₂O: 42.62 mg, ZnCl₂: 3.41 mg ve NiCl₂ * 6H₂O yerine diğer metal tuzlarını kullanarak adım 1.6.1'i tekrarlayın: 59.43 mg].
         not: ZnCl₂ çözeltisi 0.5 mM'lik bir konsantrasyona sahiptir. İyonlar ve iç kılcal duvar arasında güçlü etkileşimler gözlendiğinden, konsantrasyon 10⁴ faktörü ile azaltılmıştır.
   3. 500 μM CaCl₂ çözeltisini hazırlayın.
      1. 10 mL CaCl₂ stok solüsyonunu doldurun ve 100 mL hacimsel bir şişeye koyun.
      2. Hacimsel şişeyi işarete kadar bir Tris tamponu ile doldurun ve şişeyi sallayın.
   4. 250 μM CaCl₂ çözeltisini hazırlayın.
      1. 5 mL CaCl₂ stok solüsyonunu doldurun ve 100 mL hacimsel bir şişeye koyun.
      2. Hacimsel şişeyi işarete kadar bir Tris tamponu ile doldurun ve şişeyi sallayın.
   5. Diğer stok çözümleri için önceki adımları yineleyin.
7. Solüsyonları şişelere doldurun.
   not: Tekrarlanan her çalıştırma, bir dizi giriş ve çıkış şişesine ihtiyaç duyar. Giriş ve çıkışta taze ligand çözeltilerinin kullanılması, her çalıştırmadan sonra migrasyon süresindeki değişimleri azaltır.
   1. 250 μM CaCl₂ çözeltisini 10 mL'lik bir şırıngaya doldurun.
   2. Şırınganın üzerine 0.22 μm'lik bir PVDF filtresi koyun ve bu filtrelenmiş çözeltiyi atmak için şırıngayı kullanarak 2 mL çözeltiyi filtreden itin.
   3. Şırınganın kalan 250 μM CaCl₂ çözeltisi ile izin verilen maksimum hacme kadar 10 şişeyi doldurun. Her birini 250 μM CaCl₂ çözelti giriş şişesi olarak işaretleyin.
   4. 10 şişeyi 250 μM CaCl₂ çözeltisi ile yarıya kadar doldurun. Her birini 250 μM CaCl₂ çözelti çıkış şişesi olarak işaretleyin.
   5. Diğer metal tuzu içeren çözeltiler için 1.7.1 - 1.7.4 adımlarını tekrarlayın.
   6. Bunun yerine 30 mM Tris tampon (pH 7.4) çözeltisini kullanarak her bir giriş ve çıkış şişesi çifti için adımları tekrarlayın.
      not: 30 mmol/L Tris tamponu pH 7.4, metal iyonlarının yokluğunda protein için migrasyon süresi verilerini elde etmek için çalışmalar arasında kullanılır. EOF'deki değişiklikleri ihmal etmek gerekir.
   7. Bunun yerine asetanilid EOF-marker (60 μM) solüsyonunu kullanarak bir flakon için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Ayrıca, bunun yerine örnek (1 mg / mL) çözeltisini kullanarak bu adımları tekrarlayın.

2. Afinite Kapiler Elektroforetik Analizi

1. Kılcal damarı şartlandırın
   1. Termostatı 23 °C.
      'ye ayarlayın not: Sıcaklık, yayınlanmış protokollere göre kullanılır ve diğer sıcaklıklara değiştirilebilir. Bununla birlikte, etkileşimler sıcaklığa bağlıdır ve buna göre değişecektir.
   2. Bir kılcal damarı 40 M NaOH ile 2.5 bar'da 0.1 dakika boyunca yıkayın.
   3. Kılcal damarı 1.0 bar'da 10 dakika boyunca deiyonize su ile yıkayın.
   4. Kılcal damarı 30 mM Tris tamponu (pH 1.0) ile 30 bar'da 7.4 dakika boyunca yıkayın.
2. ACE yöntemleri için hazırlık
   1. Ligandsız ölçümler için yöntemi hazırlayın.
      not: Asetanilid, 2 protein zirvesini gizlediği için numune çözeltisine eklenmedi.
      1. Kılcal damarı 0,1 M EDTA solüsyonu ile 2,5 bar'da 1 dakika durulayın.
      2. Kılcal damarı deiyonize su ile 2,5 bar'da 1 dakika durulayın.
      3. Dengeleme için kılcal damarı 2,5 bar'da 1,5 dakika Tris tamponu ile durulayın.
      4. Asetanilid çözeltisini 6 saniye boyunca 0,05 bar'da enjekte edin ve giriş ve çıkış şişelerini Tris tampon şişelerine değiştirin.
      5. Asetanilid solüsyonunu kılcal damarın ucundan daha içeriye itmek için 2,4 saniye boyunca 0,05 bar uygulayın.
      6. 6 dakika boyunca 10.0 kV uygulayın ve 200 nm dalga boyunda asetanilid tepe noktasını tespit edin.
      7. 2.2.1.1. - 2.2.1.6. adımlarını asetanilid çözeltisi yerine protein örneğini kullanarak tekrarlayın ve tüm protein piklerini tespit edin.
   2. Ligandlarla yapılan ölçümler için yöntemi hazırlayın.
      1. Kılcal damarı 0,1 M EDTA solüsyonu ile 2,5 bar'da 1 dakika durulayın.
      2. Kılcal damarı deiyonize su ile 2,5 bar'da 1 dakika durulayın.
      3. Dengeleme için kılcal damarı ligand solüsyonu ile 2,5 bar'da 1,5 dakika durulayın.
      4. Asetanilid çözeltisini 0,05 bar'da 6 saniye boyunca enjekte edin ve giriş ve çıkış şişelerini ligand içeren tampon şişelerine değiştirin.
      5. Asetanilid solüsyonunu kılcal damarın ucundan daha içeriye itmek için 2,4 saniye boyunca 0,05 bar uygulayın.
      6. 6 dakika boyunca 10.0 kV uygulayın ve 200 nm dalga boyunda asetanilid tepe noktasını tespit edin.
      7. Asetanilid çözeltisi yerine protein örneğini kullanarak 2.2.2.1 - 2.2.2.6 adımlarını tekrarlayın ve tüm protein piklerini tespit edin.
   3. Alternatif olarak, çeşitli protein-metal iyon etkileşimleri için yük boyutu oranlarındaki değişikliği hesaplamak için 2.2.1 ve 2.2.2 adımlarını tekrarlayın.
      1. Her 60 saatte bir protein çözeltisini taze olanla değiştirin.
         not: Bu noktada, deney duraklatılabilir. Bu prosedür, ligandların her konsantrasyonu için en az 10 kez tekrarlanır, çünkü tepe paterni koşudan koşuya biraz değişir. Çözelti 60 saatten daha uzun süre kullanılırsa, varyasyonlar çok büyük olur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AtHIRD11 örneği	Shizuoka Üniversitesi (Grup Prof. M. Hara)		Escherichia coli'de eksprese edilen Arabidopsis thaliana'dan Dehidrin Proteini
Barefused silika kılcal,	Polymicro Teknolojileri (Phoenix, ABD)	106815-0017	TSP050375 50 μm iç çap, 363 μm dış çap, poliimid kaplama
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Almanya)		Kapiler elektroforez aleti; Bunun yerine Agilent 7100 CE kullanılabilir
Ampul pipeti 25 mL	Duran Group GmbH (Mainz, Almanya)	24 338 14	Ligand çözeltisinin hazırlanması
Duran glas hacimsel şişe 25 mL	Duran Group GmbH (Mainz, Almanya)	24 671 1457	Ligand stok çözeltisinin hazırlanması
Duran cam şişesi 10 mL	Duran Group GmbH (Mainz, Almanya)	24 671 1054	Ligand stok çözeltisinin hazırlanması
Asetanilid	Sigma-Aldrich (Steinheim, Almanya)	397229-5G	Elektroozmotik akış işaretleyici
Manganez (II) klorür	Sigma-Aldrich (Steinheim, Almanya)	13217	Ligand
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Almanya)	431788-100G	Durulama bileşeni
Baryumklorür	Sigma-Aldrich (Steinheim, Almanya)	202738-5G	Ligand
Nikel(II) klorür hekzahidrat	Sigma-Aldrich (Steinheim, Almanya)	654507-5G	Ligand
Selenyum(IV) klorür	Sigma-Aldrich (Steinheim, Almanya)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hidroksimetilpropan-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Almanya)	252859-100G	Tampon bileşen
Çinko(II) klorür	Merck Millipore ( Darmstadt, Almanya)	1088160250	Ligand
Stronsiyum nitrat	Merck Millipore ( Darmstadt, Almanya)	1078720250	Ligand
Kalsiyum klorür dihidrat	Merck Millipore ( Darmstadt, Almanya)	1371015000	Ligand
Bakır(II) klorür dihidrat	Riedel-de Haën (Seelze, Almanya)	31286	Ligand
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Almanya)	G2070-91126	CE cihazlarını çalıştırmak, verileri elde etmek ve değerlendirmek için yazılım paketleri