$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Numunelerin Hazırlanması
- Nöroşirürji bölümünden hipofiz adenom dokularını (0.2 - 0.5 mg) toplayın. Hemen sıvı nitrojeni dondurun ve ardından saklama için -80 ° C'ye aktarın.
- Deiyonize damıtılmış suya (ddH2O) 2 mL% 0.9 NaCl ekleyin. Kanı doku yüzeyinden hafifçe yıkamak için bu solüsyonu kullanın (3x).
NOTE: Protokol boyunca 18.2 MΩ/cm iletkenliğe sahip ddH2O kullanılmıştır. Bir dokunun yüzeyinden kan yıkanırken dokunun bir kısmı kaybolabilir.
- Her 0,5 - 0,6 g doku için 2 M asetik asit ve% 0,1 (h/h) β-merkaptoetanol içeren çözeltinin bir hacmini (10 mL; 4 ° C) ekleyin, homojenize edin (1 dakika, 13.000 rpm, 4 ° C, 10x) bir doku homojenizatörü ile, homojenatı 20 saniye boyunca sonikleştirin, liyofilize edin ve -80 ° C'de saklayın.
- Liyofilize edilmiş, homojenize edilmiş numunelerin protein içeriğini bikinkoninik asit (BCA) tahlil kiti kullanarak ölçün.
not: BCA nicelemesi mutlak bir nicelik belirlemesi değildir ve ölçülen sonuç farklı bir teknisyen ve deney ajanı ile değiştirilecektir. Farklı deneyler için sabit konsantrasyonlu bir numune standardı kullanılmalıdır. Bu nedenle, her bir 2D jel için proteinlerin nihai yükleme miktarı, önceden tasarlanmış deneylerde gümüş lekeli veya Coomassie lekeli iyi çözünürlüklü görüntü ile belirlenecektir.
Bir - hacim (282 μL) protein ekstrakte edici tampona (8 M üre ve% 4 CHAPS) yaklaşık 300 μg liyofilize homojenize numune ekleyin, ardından 2 saat bekletin, 5 dakika boyunca bir su banyosunda sonikasyon, 1 saat döndürün, 5 dakika boyunca su banyosunda tekrar sonikasyon, 1 saat boyunca tekrar döndürün, ve 20 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleme.
- Ticari BSA standardı (2 mg / mL) ile 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 μg / mL belirtilen konsantrasyonlarda BSA standart çözeltileri hazırlayın.
- Kullanmadan önce BCA reaktifi A ve B'yi (A: B = 50: 1) BCA çalışma çözeltisi olarak karıştırın.
- Bir mikrofüj tüpünde 2 mL BCA çalışma çözeltisine 0.1 mL numune veya standart çözelti ekleyin, ardından karıştırın ve ardından 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Son olarak oda sıcaklığında 10 dakika soğutun ve562 nm OD değerini ölçün.
- A562 nm değerine sahip numune protein içeriğini hesaplamak için bir regresyon denklemi elde etmek için standart doğrusal çizgiyi (A562 nm'ye karşı BSA konsantrasyonu) hesaplayın.
- Gümüş boyama için 150 μg protein eşdeğeri liyofilize numune veya 18 cm hareketsizleştirilmiş pH gradyanı (IPG) şeridi pH 3-10 doğrusal olmayan (NL) için Coomassie boyama için 500 μg protein kullanın.
not: IPG kuru şerit, 0,5 mm kalınlığında ve 3 mm genişliğindedir, 7, 11, 13, 18 ve 24 cm dahil olmak üzere farklı uzunluklara ve doğrusal veya doğrusal olmayan pH gradyanında pH 4-5, 4-7, 6-9 ve 3-10 dahil olmak üzere farklı pH aralıklarına sahiptir. Kullanılan IPG tamponu şeride uygun olmalıdır.
- 250 μL ekstraksiyon tamponu ekleyin (7 M üre, 2 M tiyoüre,% 4 (a / h) CHAPS, 100 mM DTT (kullanımdan önce ekleyin),% 0.5 v / v farmalit (kullanımdan önce ekleyin) ve bir miktar bromofenol mavisi).
- Çözeltiyi 30 ° C'nin altında tutun, ardından 5 dakika girdaplama, 5 dakika sonikasyon ve 50 dakika döndürme
.
- 110 μL rehidrasyon tamponu ekleyin (7 M üre, 2 M tiyoüre,% 4 (a / h) CHAPS, 60 mM DTT (kullanımdan önce ekleyin),% 0.5 v / v IPG tamponu (kullanımdan önce ekleyin) ve bir miktar bromofenol mavisi). 5 dakika boyunca sonikate. Daha sonra numuneyi 50 dakika döndürün, 5 dakika girdap yapın ve 15.000 x g'da 20 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı (350 μL) protein numune çözeltisi olarak toplayın.
2. İki Boyutlu Jel Elektroforezi
- IEF (Birinci boyut): Aşağıda açıklandığı gibi izoelektrik odaklama sistemi üzerinde IEF gerçekleştirin.
- 18 cm'lik bir IPG şerit tutucunun yuvasına 350 μL protein numune çözeltisi ekleyin.
- Protein numune çözeltisinin üzerine jel tarafı aşağı bakacak şekilde 18 cm'lik bir IPG şeridi koyun (kabarcıklardan kaçının).
- IPG şeridini kaplamak için 3-4 mL mineral yağ ekleyin.
- IPG şerit tutucuyu, sivri ucu arka (+) plakada ve kare ucu ön (-) plakada olacak şekilde izoelektrik odaklama sistemine monte edin.
- Gece boyunca rehidrate edin (oda sıcaklığında ~ 18 saat).
- IEF parametrelerini ayarlayın: şerit başına maksimum akım 30 μA, 20 °C; 250 V, 1 saat, 125 Vh, adım ve tutma; 1.000 V, 1 saat, 500 Vh, gradyan; 8.000 V, 1 saat, 4.000 Vh, gradyan; 8.000 V, 4 saat, 32.000 Vh, adım ve tutma; ve 500 V, 0.5 saat, 250 Vh, adım ve tutma. Toplam 7.5 saat ve 36.875 Vh süreye kadar çalışmasına izin verin.
- IEF'den sonra, her bir IPG şeridini çıkarın ve fazla mineral yağı çözünmeyen bir kağıt havluyla çıkarın. Şimdi şeridi bir streç filme sarın ve -80 °C.
'de saklayın
not: IPG şerit tutucu, IPG şerit tutucu temizleme solüsyonu ve damıtılmış su ile temizlenmelidir.
- SDS-PAGE (İkinci boyut): Dikey Hücre Elektroforez Sisteminde SDS-PAGE gerçekleştirin
not: Her SDS-PAGE jel boyutu 255 x 190 x 1 mm olmalıdır.
- %12 PAGE çözücü jelleri dökmek için çok jelli bir tekerlek kullanın. %12 PAGE jelleri dökmek için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- 270 mL ddH2O, 150 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 180 mL %40 (a/h) akrilamid/bisakrilamid stok çözeltisi (29:1, %40 w/v akrilamid ve %1.38 w/v N, N'-metilenbisakrilamid), 3 mL %10 amonyum persülfat ve 150 μL TEMED ekleyin jel çözeltisini bir beherde yapmak için. Yavaşça karıştırın ve kabarcıklardan kaçının.
- Jel solüsyonunu, beklenen jel yüksekliğine (19 cm) kadar çok döküm haznesine nazikçe dökün.
- Jelleri kaplamak için hemen her çözülen jele yaklaşık 3 mL ddH2O ekleyin. Jelin yaklaşık 1 saat polimerize olmasına izin verin.
- 20 L elektroforez tamponu hazırlayın (25 mM Tris, 192 mM gliserin ve% 0.1 SDS). Elektroforez ayırma ünitesi tampon tankını bu tamponla doldurun.
- Odaklanmış IPG şeritlerini dondurucudan çıkarın ve şeritleri 10 mL indirgeyici denge tamponunda (4 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M üre, %2 (a/h) SDS, %20 (h/h) gliserol, %2 w/v DTT (kullanımdan önce ekleyin) ve eser miktarda bromofenol mavisi).
- İndirgenmiş IPG şeritlerini 4 mL alkilasyon denge tamponunda (375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M üre, %2 (a/h) SDS, %20 (h/h) gliserol, %2.5 w/v iyodoasetamid (kullanmadan önce ekleyin) ve bir eser miktarda bromofenol mavisi).
- Jel dengesi sırasında, çok noktaya yayın odasını sökün ve hazırlanan çözünen jel kasetini çıkarın. 3x'i ddH2O ile durulayın. Fazla ddH2O'yu çözünmeyen bir kağıt havluyla çıkarın ve bir jel stander'a koyun.
- Dengelenmiş IPG şeritlerini elektroforez tamponu ile durulayın ve çözünmeyen kağıt havluyla IPG şeridi yüzeyindeki fazla sıvıyı alın.
- Çözülen SDS-PAGE jelinin üzerine bir IPG şeridi koyun ve IPG şeridinin plastik tarafının daha uzun cam plakaya ve sola doğru sivri uca temas etmesine izin verin.
- Her bir SDS-PAGE jelinin üstündeki IPG şeridini kapatmak için SDS elektroforez tamponuna (~ 80 ° C) hızlı bir şekilde 3-4 mL sıcak% 1 agaroz dökün ve IPG şeridinin üst tarafını kabarcıklar olmadan daha kısa cam plakanın üstüne koyun ve ardından 10 dakika polimerize edin.
- Monte edilmiş jel kasetini dikey elektroforez sistemindeki plastik contalar arasına dikey olarak yerleştirin. Jelin üst kısmını, IPG şeridi ile katodun (-) yanına koyun.
- Jel kasetini daldırmak için elektroforez tamponu seviyesini ayarlayın.
- Güç Kaynağını/Kontrol Ünitesini bağlayın ve sabit voltaj moduna ayarlayın ve boyayı izlerken yaklaşık 200 dakika boyunca 370 V'ta çalıştırın.
- Çalıştırdıktan sonra, jel kasetini elektroforez sisteminden çıkarın ve jelin yırtılmasını ve ardından 2DE ile ayrılmış proteinlerin lekelenmesini önleyerek jeli jel kasetinden nazikçe çıkarın.