Zymography Jel Elektroforezi: Enzimatik aktiviteyi değerlendirerek matris metaloproteinazları tespit etmek için elektroforetik bir teknik

Özet

Kaynak: Hu, X. ve diğerleri, Zymografi ile Fonksiyonel Matriks Metalloproteinazlarının Tespiti. J. Vis. Uzm. (2010)

Bu video, hücre kültürü süpernatanında bulunan matris metaloproteinazların (MMP'ler) aktivitesini değerlendirmek için zimografi jel elektroforezi tekniğini göstermektedir. Aktif MMP'ler, boyamayı takiben koyu lekeli bir arka plana karşı şeffaf bantlar olarak görünen bir poliakrilamid jel içine gömülü MMP'ye özgü substratı bozar.

Protokol

1. Jeli Yükleme ve Çalıştırma

1. Tüm numuneler, enzimlerin işlevini sürdürmek için uygun şekilde hazırlanmalı ve toplandıktan hemen sonra kullanılmalı veya -80°C'de dondurularak saklanmalıdır. Numuneler indirgeyici maddeler (β-merkaptoetanol gibi) içermemeli veya jel yüklemeden önce kaynatılmamalıdır.
2. Bir kasetin içinde jel bulunan poşeti açın, kaseti deiyonize su ile durulayın.
   1. Kasetin altındaki koruyucu bandı ve jelin üst kısmındaki tarağı çıkarın.
   2. Kuyuları çalışan tamponla üç kez durulayın (deiyonize suda 1X'e kadar seyreltilmiş).
   3. Jeli Mini-Cell'e yerleştirin ve kasetin küçük tarafının içe baktığından emin olun. Jel Gergi Kaması ile yerine kilitleyin. Mini-Cell, bir veya iki jelin paralel olarak çalışmasına izin verir.
   4. Üst (iç) hazneyi kuyu seviyesinin üzerinde 1X çalışma tamponu ile doldurun, herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sızıntı olması durumunda tamponu çıkarın ve jeli yeniden konumlandırın.
   5. Alt hazneyi 1X çalışma tamponu ile doldurun.
3. Bir kuyucuğa 10 μL protein moleküler markörü yükleyin.
   1. Eşit miktarda jel yükleme tamponu ve numuneyi karıştırın ve jel yükleme uçlarını (her numune arasında değiştirilir) kullanarak jelin kuyucuklarına yükleyin. Bu kuyular toplam 20 μL'ye kadar yüklenebilir.
4. Kapağı Mini-Cell'in üzerine yerleştirin ve elektrot kablolarını güç kaynağına bağlayın. Güç kaynağını açın ve 125 dakika boyunca 90 V sabitte çalışacak şekilde ayarlayın. Alt haznenin telinde akım sirkülasyonunu gösteren küçük kabarcıkların oluşumunu kontrol edin.
5. İlk jelinizi çalıştırırken, yükleme tamponunda bulunan bromofenol mavisini bir gösterge olarak kullanarak her 15 dakikada bir migrasyonun ilerlemesini izleyin. İndikatör boyası jelin dibine ulaşana kadar jelin çalışmasına izin verin.

2. Jeli Yeniden Doğallaştırma ve Geliştirme

1. Her jel için, her ikisi de deiyonize suda 100 mL 1X renatüre edici tampon ve 200 mL denatüre edici tampon hazırlayın.
2. Bromofenol mavisi izleme boyası jelin dibine ulaştığında, güç kaynağını kapatın, Mini-Cell'i açın ve jeli çıkarın. Jel bıçağı (veya tartıcı bir spatula) kullanarak kasetin iki tarafını ayırın. Jelin yönünü işaretlemek için bir köşe kesin.
3. Jeli kasetten dikkatlice çıkarın ve 100 mL renatüre edici tamponu olan bir kaba koyun. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
4. Renatüre edici tamponu çıkarın ve jele 100 mL geliştirme tamponu ekleyin. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
5. Gelişmekte olan tamponu çıkarın ve jele 100 mL daha fazla geliştirme tamponu ekleyin. Gece boyunca (16-18 saat) 37 ° C'de inkübe edin.
6. Gelişmekte olan tamponu çıkarın ve oda sıcaklığında hafif çalkalama altında deiyonize su ile üç kez (her biri 5 dakika) durulayın.
7. Protein standart bantlarının tam konumunu korumak için jeli tarayın, çünkü jel boyamadan sonra daha az görünür hale gelirler veya görünmez olurlar.
8. Jele 20 mL SimplyBlue Safestain ekleyerek jeli lekeleyin. Hafif çalkalama altında oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
9. SimplyBlue SafeStain'i çıkarın ve jeli 100 mL veya daha fazla deiyonize suda oda sıcaklığında bir saat boyunca hafif çalkalama altında lekeden arındırın.
10. Daha iyi sonuçlar için, taze deiyonize su ile değiştirin ve hafif çalkalama altında oda sıcaklığında bir saat veya daha fazla inkübe edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Xcell SureLock Mini-Cell CE işaretli elektroforez cihazı	Canlandırıcı	EI0001
Güç kaynağı (model 302)	VWR (VWR)	93000-744
Novex% 10 jelatin zimogram jelleri, 1.0 mm, 12 kuyu	Canlandırıcı	EC61752BOX
Blue Juice jel yükleme tamponu	Canlandırıcı	10816015
Jel yükleme ipuçları	VWR (VWR)	53509-015
Protein moleküler ağırlık standardı	Canlandırıcı	LC5800
Novex Tris-Glisin-SDS çalışma tamponu	Canlandırıcı	LC2675
Novex zymogram renatüre edici tampon	Canlandırıcı	LC2670
Novex zymogram geliştirme tamponu	Canlandırıcı	LC2671
BasitMavi Güvenli Leke	Canlandırıcı	LC6060

Serisi arası Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi