Bir tüp oluşum denemesi tümör hücrelerinin damar etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tümör Hücrelerinin vaskülojenik Faaliyet değerlendirin bir Matrigel Tabanlı Tüp Oluşumu Testi
Bu makalede
Özet
Özet
Geçtiğimiz birkaç on yıl içinde, bir tüp oluşum denemesi büyüme kullanarak faktör-azaltılmış Matrigel genellikle vasküler endotelyal hücrelerin in vitro 1-5 anjiyogenik faaliyet göstermek için istihdam edilmiştir . Ancak, son zamanlarda giderek artan kanıtlar, bu testte, vasküler endotelyal hücreler için davranış test etmek için sınırlı olmadığını göstermiştir. Bunun yerine, aynı zamanda tümör hücrelerinin damar fenotip 6-8 geliştirmek için bir dizi yeteneğini test etmek için kullanılır olmuştur . Bu yeteneği, xenotransplanted hayvanlar, vaskülojenik taklit (VM) 9 olarak bilinen bir süreç olarak tanımlanan vaskülojenik davranışı ile uyumlu idi . Tümör hücre-aracılı VM, endotelyal hücre anjiyogenez 6, 10-13, bağımsız, tümör gelişiminde hayati bir rol oynar gösteren çok sayıda kanıt vardır. Örneğin, tümör hücrelerinin melanoma ve glioblastoma hasta 8, 10, 11 kan, doku örnekleri perfüze, vasküler kanal oluşumu katılmak bulundu . Burada, tümör hücrelerinin vaskülojenik aktivite değerlendirilmesi yararlı bir araç olarak bu borulu şebeke tahlil nitelendirdi. Biz böyle melanom B16F1 hücreleri, glioblastoma U87 hücreleri ve meme kanseri MDA-MB-435 hücre gibi bazı tümör hücre hatları vasküler tübüller formu mümkün olduğunu, ancak bazı kolon kanseri HCT116 hücreleri gibi değil. Ayrıca, bu vasküler fenotip Matrigel kaplanmış hücre sayıları bağlıdır. Bu nedenle, bu testte vasküler potansiyel vasküler hücreler, tümör hücreleri gibi diğer hücrelere de dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri ekrana güçlü bir yardımcı olarak hizmet verebilir.
Protokol
1. Tümör Hücrelerinin vaskülojenik Faaliyet değerlendirin bir Matrigel Tabanlı Tüp Oluşumu Testi
- , Tümör hücreleri ve mikrovasküler endotel hücreleri Hazırlanması: U87 hücreleri, melanom hücrelerinin B16F1, meme kanseri MDA-MB-435 ve kolon hücrelerinin HCT116 gibi beyin tümör hücreleri (% 10 FBS ve penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM yetiştirilen tüm Invitrogen gelen .) Endotel hücre hattı insan mikrovasküler endotel hücreleri (HMVECs) 1 mcg / ml hidrokortizon ve 1 ng / ml epidermal büyüme faktörü,% 10 FBS ve penisilin / streptomisin ile desteklenmiş EBM2 orta (Lonza) kültüre edildi. Hücreler PBS üç kez yıkanır ve% 0.05 tripsin / EDTA (Invitrogen) ile müstakil edildi. 2,000 rpm ile 5 dakika süreyle santrifüj sonra, hücre pelletleri tekrar PBS ile yıkandı. Sonra, bir hemasitometre pelet hücreleri sayıldı.
- Matrigel hazırlık: Bir kısım büyüme faktörü-azaltılmış Matrigel (BD Bioscience), oda sıcaklığında ısınmış. Tamamen çözülmüş önce, buz üzerine transfer edildi ve sıvı, en az 10 dakika boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. Sonra Matrigel 50 ul Matrigel eşit olarak dağıtmak için izin veren bir yatay düzeyde 96-kuyucuğu kaplama, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edildi
- Tüp oluşumu: hücreler (1-2 x 10 4), endotel hücreleri tümör hücrelerinin ya da EBM-2 serum serbest DMEM ile yeniden askıya alınan ve Matrigel üst üzerinde yüklü idi . Bu testte tübül gelişimi üzerine bazı ajanların etkilerini ölçmek için kullanılmış ise, bu ajanlar (uyarıcıları veya inhibitörleri), serum serbest orta eklendi. Her koşullu grup 4-6 kuyu içeriyordu.
- Görüntü ve veri analizi: 37 takiben kuluçka ° C gecede, her iyi, doğrudan mikroskop altında incelendi. Tübüller sabitleme için gerekli olsaydı,% 10 formalin tuzlu tabanlı çözüm ul 100 nazikçe eklendi ve on dakika sonra, analiz için hazır. 10x faz kontrast mikroskop altında, her alanda tübüller görüntülü ve ortalama 3-5 rastgele alanlardan her kuyuda Tübüllerin bir sayılmıştır.
2. Temsilcisi Sonuçlar:
Bu tübüller, poligon ağı oluşturmak bağlanmak uzatılmış hücre gövdeleri üretilmişti HMVECs, pozitif kontrol olarak kullanıldı. B16F1, U87 ve MDA-MB-435 hücre HMVECs tarafından oluşturulan benzer vasküler tübüller geliştirilmiş, ancak HCT116 hücreleri (Şekil 1) vermedi. Doza bağımlı bir hücre tüp oluşumu U87 hücreleri test edildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, 10.000 hücreleri durdurulan tübüller kurdu. Hücrelerin iki katına sonra, sağlam bir damar ağı HMVECs olarak görülen karşılaştırılabilir. Buna karşılık, 5.000 'den az hücreleri vasküler bir fenotip oluşturmak için başarısız oldu.
Şekil 1 Tüp oluşumu HMVECs, U87, MDA-MB-435, ve B16F1 hücreleri tarafından uyarılan, ancak HCT116 hücreler, tüm hücrelerin (2 x 10 4) Matrigel üzerinde yüklü olan ve gece boyunca inkübe edildi . Tübüller faz kontrast kullanılarak görüntülenmiştir. HMVECs Pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. 3-5 alanların bir temsilci gösterildi. Bar: 100 mikron.
Şekil 2 hücre sayısı bağımlı bir şekilde hücre kaynaklı U87 tübüller Farklı sayıda köşeleri belirtildiği gibi U87 hücrelerinin tüp oluşumu için kullanılmıştır. HMVECs pozitif kontrol için kullanılmıştır. Bar: 100 mm.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu testte başarılı olmak için, Matrigel kalitesini ilk test edilmelidir. Bioscience BD HMVECs kullanarak tahlil öncesi çalıştırmak için küçük bir örnek alınabilir. Farklı parti ürünleri, bazı çok sayıda tüp oluşumu için en uygun durumda vermezseniz hangi benzemeyen nitelikler gösterebilir. Matrigel bir kısım 96-kuyucuğu yüklendiğinde kabarcıkları tübül oluşumu bozabilir çünkü İkincisi, herhangi bir kabarcıkları kaçınılmalıdır olmalıdır. Minik kabarcıklar iyi tespit edilirse, Matrigel hemen deney sırasında buz üzerinde t...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma NCI R01 CA120659 (SC) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| Büyüme faktörü-azaltılmış Matrigel | Bioscience BD | 47743-720 | |
| EBM2 kiti | Lonza | CC-3156 | |
| Nikon ECLIPSE TS100 mikroskop | Nikon |
Kaynaklar
- Shao, R., Guo, X. Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis. Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).
- Ribeiro, M. J. Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium. Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).
- Ades, E. W. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99, 683-690 (1992).
- Shao, R. Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression. Molecular & Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).
- Shao, R. YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis. Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).
- Basu, G. D. A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells. Breast Cancer Research. 8, R69-R69 (2006).
- Scavelli, C. Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma. Oncogene. 27, 663-674 (2008).
- El Hallani, S. A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry. Brain. 133, 973-982 (2010).
- Maniotis, A. J. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).
- Hendrix, M. J., Seftor, E. A., Hess, A. R., Seftor, R. E. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma. Nature Reviews Cancer. 3, 411-421 (2003).
- Folberg, R. Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns. American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).
- Liu, C. Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors. Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).
- Sood, A. K. The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy. Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).
- Shirakawa, K. Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft. Cancer Research. 62, 560-566 (2002).
- Ruf, W. Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry. Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).
- Seftor, R. E. Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma. Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).
- Shirakawa, K. Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer. International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
