Viral Genomu Ölçmek için Nokta Blot Testi

>NOT: Bu protokol için gerekli çözeltiler ve tamponlar için tarifler Tablo 1'de verilmiştir.

1. Nokta lekesi

1. Plazmid DNA standartlarının hazırlanması
   1. AAV vektör genom plazmid DNA'sını su veya Tris-HCl tamponunda (10 mM, pH 8.0) 10 ng / μL'ye seyreltin. Bu seyreltmenin 25 μL'sini alın ve plazmit DNA'yı 50 μL.
      'lik bir reaksiyon hacminde doğrusallaştırmak için 1 saat boyunca uygun bir kısıtlama enzimi ile sindirin not: Çoğaltılmış bir sindirim seti oluştururuz (bkz. adım 1.4.1). Uygun enzim, plazmit DNA'yı nokta leke probu bağlama bölgesinin dışında kesen enzim olmalıdır. Kolaylık sağlamak için, seyreltilmiş plazmit DNA aliquoted (25 μL/tüp) ve ileride kullanılmak üzere -20 °C'de donmuş olarak saklanabilir. Adım 5.1'de tüpler çalkalanırken plazmit DNA'sını sindirin. Plazmit DNA standardını aşırı sindirmeyin.
   2. Sindirilmiş plazmit DNA standardını içeren tüpe 450 μL su veya TE ekleyin ve iyice karıştırın. Bu karışımın 70 μL'sini, seyreltilmiş bir plazmit standardı (25 pg / μL) yapmak için 1.330 μL su veya TE içeren yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   3. İki katlı seri seyreltme (600 μL/tüp) seti oluşturmak için Tablo 1'i takip edin. Seyreltmeleri 5 saniye girdaplayarak iyice karıştırın.
2. Standartların ve viral DNA örneklerinin denatüre edilmesi
   1. Her standart seyreltmeye 600 μL 2x Alkali Çözelti ekleyin. 5 ila 10 saniye girdap yaparak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   2. Her viral DNA örneğine 120 μL 2x Alkali Çözelti ekleyin. 5 ila 10 saniye girdap yaparak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
3. Nokta leke aparatının kurulması
   1. Makas kullanarak, bir lekeleme (örneğin, zeta probu) membranını numune sayısı ve standartlar için uygun bir boyutta kesin. Membranı bir nokta leke aparatına yerleştirmeden önce 10 dakika su ile ıslatın. Membran aparatı üzerindeki kullanılmayan kuyuları kapatın.
      not: Membranı temiz cımbızla tutun. Boş kuyuları kapatmak için membran ile birlikte gelen açık mavi koruma levhası kullanılabilir. Numuneleri ve standartları bağlamadan önce zarın kurumasına izin vermeyin. Cihazın montajı ve kullanımı hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen kullanım kılavuzuna bakın.
   2. Numunelerin yükleneceği kuyucuklara su ekleyin. Hataları kontrol etmek için vakum uygulayın ve kuyulardan su çekin ve düzeltildiğinde tekrar test edin. Sıkı sızdırmazlık sağlamak için vakum uygularken vidaları yeniden sıkın.
      not: Eksik sızdırmazlık, kuyucuklar arasında numune sızıntısına neden olabilir.
   3. Su tamamen çekildikten sonra, vakumu tamamen serbest bırakın (yani, vakum manifoldu hava basıncına açık olmalıdır).
4. Standartların ve numunelerin nokta leke aparatına yüklenmesi
   1. Her bir oyuğa her seyreltilmiş plazmit DNA standardından 400 μL uygulayın ve dört şerit standart seyreltme çalıştırın. Standart özetin iki ayrı alikotunu kullanın ve her birini kopya olarak yükleyin. Her viral DNA örneğinden 200 μL/kuyucuk uygulayın.
      not: Kalan ~40 μL denatüre numuneler kullanılarak, seyreltilmiş numuneler hazırlanabilir (örneğin, 20 μL numune artı 180 μL 1x Alkali Çözelti kullanılarak 10 kat seyreltilmiş numuneler) ve gerekirse lekelenebilir.
   2. DNA solüsyonlarını kuyudan çekmek için hafif bir vakum uygulayın.
      not: Vakum basıncının, üç bir vananın kısmen açılmasıyla ayarlanması gerekir, böylece vakum basıncı nokta leke aparatına ve atmosfere uygulanır (yani, musluk kolları daha yüksek bir emme sesi çıkardığı yaklaşık 45°'lik bir açıyla konumlandırılmış durumda).
   3. Tüm kuyular boşaldıktan sonra, üç vanayı ayarlayarak vakumu serbest bırakın. Standartları ve numuneleri içeren her oyuğa 400 μL 1x Alkali Çözelti ekleyin. Kuyuları boşaltmak için vakumu yeniden uygulamadan önce 5 dakika bekleyin.
   4. Vakumu aynı şekilde tekrar uygulayın.
   5. Nokta leke aparatını vakum altında sökün, zarı çıkarın ve 2x SSC ile durulayın. Fazla 2x SSC'yi çıkarmak için membranı DNA'ya bağlı tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.
   6. Lekelenmiş DNA'yı uygun bir UV çapraz bağlayıcı ile zara UV çapraz bağlayın; zar artık hibridizasyon için hazırdır.
      not: UV çapraz bağlama için ıslak membranlar kullanılabilir. Kurutulmuş, UV çapraz bağlı membranlar oda sıcaklığında saklanabilir. Daha fazla bilgi Malzeme Tablosunda bulunabilir.

2. Hibridizasyon ve yıkama

1. Hibridizasyon Tamponunu 65 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
2. Bir DNA probunu radyoaktif ^α-32P dCTP ile enzimatik olarak etiketleyin ve üreticinin tavsiyesine göre piyasada bulunan kitleri kullanarak saflaştırın.
   not: Viral genomda bir arttırıcı-promotör bölgeden veya protein kodlayan bir diziden 0.5-2.0 kb uzunluğunda bir prob kullanıyoruz. Bu protokol, sinyal tespiti için ³²P etiketli radyoaktif prob kullansa da, radyoaktif olmayan kemilüminesan veya floresan problar da kullanılabilir (lütfen Tartışma bölümüne bakın).
3. Membranı DNA'ya bağlı tarafı yukarı bakacak şekilde bir hibridizasyon şişesine yerleştirin, membranı 5 mL önceden ısıtılmış Hibridizasyon Tamponu ile durulayın ve tamponu atın. Daha sonra 10 mL önceden ısıtılmış Hibridizasyon Tamponu ekleyin ve şişeyi 65 °C'ye ayarlanmış döner bir hibridizasyon fırınına yerleştirin. ≥5 dakika döndürün.
4. 20 μL 10 mg / mL kesilmiş ringa balığı veya somon spermi DNA solüsyonu ve ³²P etiketli prob (≥10⁷ cpm) tüpleri 100 °C'de ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirerek 5 dakika süreyle ısıyla denatüre edin. Daha sonra ≥2 dakika buz üzerinde soğutun, kısa bir süre döndürün ve kullanılana kadar buz üzerinde tutun.
   Dikkat: Radyoaktif DNA probları için vidalı kapaklı ve O-ringli 1,5 mL tüpler kullanılmalıdır.
5. Denatüre edilmiş sperm DNA'sını ve radyoaktif probu, hibridizasyon şişesindeki Hibridizasyon Tamponuna hızlı bir şekilde ekleyin ve şişeyi karıştırmak için 10 saniye çalkalayın. Şişeyi 65 °C fırına geri koyun ve şişeyi 65 °C'de ≥4 saat döndürerek inkübe edin.
6. Hibridizasyon tamamlandıktan sonra, dönüşü durdurun, hibridizasyon şişesini çıkarın ve ardından radyoaktif prob çözeltisini sızdırmaz tapa contalı 50 mL'lik konik bir tüpe dökün. Probu, radyoaktif maddeler için ayrılmış bir buzdolabına yerleştirilmiş uygun bir kapta saklayın.
   not: 4 °C'de depolanan bir prob ile kullanılmış Hibridizasyon Tamponu, 50 mL'lik konik tüpün 100 °C'lik bir su banyosuna 5 dakika boyunca Hibridizasyon Tamponu içeren sızdırmaz bir tapa conta kapağı ile yerleştirilmesiyle en az 5 kez tekrar kullanılabilir.
7. Membranı 65 °C'ye ısıtılmış Yıkama Tamponu ile yıkayın. Hibridizasyon şişesine 20 ila 30 mL Yıkama Tamponu ekleyin ve 5 dakika döndürün. Bu yıkamayı 2 kez daha tekrarlayın.
   not: Yıkama solüsyonlarının radyoaktivitesini ölçün ve yerel enstitü tarafından istenmesi halinde kaydedin.
8. Membranı yıkarken, 5 dakika boyunca bir görüntü silgisine fosfor görüntüleme ekranı yerleştirin.
9. Üçüncü yıkamadan sonra, zarı hibridizasyon şişesinden çıkarın, zar üzerindeki fazla tamponu kağıt havluyla çıkarın ve zarı şeffaf plastik bir kağıt tutucuya yerleştirin. Bir Geiger sayacı kullanarak membran üzerindeki radyoaktif sinyalleri kontrol edin. Silinen fosfor görüntüleme ekranını, sinyal yoğunluğuna bağlı olarak 10 dakika ila gece boyunca zara maruz bırakın.
10. Bir fosfor görüntü tarama sistemi kullanarak ekranı tarayın ve her noktanın sinyal yoğunluğu hakkındaki verileri elde edin.

Tablo 1: Kantitatif nokta leke plazmid DNA standartları. İki katlı seri seyreltmelerle (600 μL/tüp) plazmit DNA standartlarını hazırlamak için gerekli hacimlerde 25 pg/μL plazmit DNA standart çözeltisi ve su veya TE gösterilmiştir. Plazmit DNA standart kolonundaki (0.039 ila 5 ng) sayılar, her bir plazmit DNA standart çözeltisinin 200 μL'sindeki DNA miktarıdır.