1. Numune Hazırlama
- 50 mg fare dokusunu 1.5 mL'lik bir tüpe alın. 200 μL lizis tamponu ekleyin (50 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7,% 1 Triton X-100,% 10 gliserol), proteaz ve fosfataz inhibitörleri (100 mM NaF, 0.1 mM fenilmetilsülfonil florür, 5 μg / mL pepstatin, 10 μg / mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin).
- Dokuyu homojenizatör ile buz üzerinde 1 dakika homojenize edin.
- 4 ° C'de 8.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı yeni tüplere (1.5 mL) toplayın ve bir BCA kiti ile protein konsantrasyonu testi için 1 μL çıkarın.
NOT: Western blot analizi ve Dot blot analizi için yaygın olarak kullanılan tüm lizis tamponları QDB analizi için kullanılabilir.
2. Antikorun Özgüllüğünün Belirlenmesi
- Western blot analizi için bölüm 1.4'te numune lizatları (20 μg), IgG içermeyen BSA (20 μg) ve standart protein (600 pg) hazırlayın.
NOT: IgG içermeyen BSA negatif kontrol olarak kullanılır ve standart protein pozitif kontrol olarak kullanılır. Antikorun özgüllüğü, western blot analizi kullanılarak doğru boyutta bir bant gösterilerek gösterilir.
3. QDB Analizinin Doğrusal Aralığını Tanımlama
- Standart proteini ddH2O ile çözün. Proteini 1.200 pg / μL konsantrasyona seyreltin.
- Hazırlanan numunelerden konsantre proteini bölüm 1.4 ila 4 μg/μL'de seyreltin.
- Proteini 1.200 pg/ μL ve 4 μg / μL konsantrasyona seyreltin.
- Tablo 1 ve Tablo 2'nin rehberliğinde bir dizi standart protein dilüsyonu ve hazırlanan örnekler hazırlandı.
- 10 μL seyreltme standart protein veya seyreltme ile hazırlanmış numuneleri ve 10 μL 2x yükleme tamponunu (120mM Tris-HCl pH 6.8, %20 Gliserol, %4 SDS, %0.2 Bromphenol Blue, 200 mM DTT) karıştırın.
- Karışımları 85 °C'de 5 dakika ısıtın.
4. QDB Analiz Süreci
- Örnek uygulama
- Plakanın alt kısmının masanın yüzeyine temas etmesini önlemek için QDB plakasını destekleyin. Örneğin, destek olarak boş bir pipet ucu kutusu kullanın.
- 2 μL'ye kadar numune yükleyin.amp, QDB plakasının ayrı biriminin altındaki zarın merkezine.
- Plakanın kurutulması
- Yüklü QDB plakasını 1 saat oda sıcaklığında (RT) bırakın veya alternatif olarak yüklü plakayı 37 °C'de 15 dakika boyunca iyi havalandırılan bir yerde bırakın.
- Plakanın bloke edilmesi
- QDB plakasını transfer tamponuna (0.039 M Glisin, 0.048 M Tris, %0.37 SDS, %20 metil alkol) batırın ve plakayı 10 saniye boyunca hafifçe sallayın.
- QDB plakasını TBST (Tris tamponlu tuzlu su, %0.1 Tween 20) ile üç kez nazikçe durulayın ve ardından plakayı sürekli çalkalayarak TBST'de 5 dakika yıkayın.
- QDB plakasını sürekli çalkalama altında 1 saat boyunca bloke edici tampon (TBST'de (100 μL/kuyu) %5 yağsız süt) ile bloke edin.
- Birincil antikor inkübasyonu
- Bloke edici tampondaki birincil antikoru seçilen bir konsantrasyonda (1: 500 ila 1: 5.000) seyreltin ve sıradan bir 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 μL ekleyin. QDB plakasını 96 oyuklu plakaya yerleştirin ve birleşik plakaları RT'de 2 saat veya sürekli çalkalama altında gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Alternatif olarak, QDB plakasını bir kutunun içine yerleştirin ve tüm plaka için aynı antikor kullanılıyorsa, kutuyu plakanın membran kısmının 2 ila 3 mm üzerinde bir engelleme tamponu ile doldurun. Seçilen konsantrasyonda birincil antikoru ekleyin ve plakayı RT'de 2 saat veya gece boyunca sürekli çalkalama altında 4 ° C'de inkübe edin.
- Plakayı TBST ile üç kez yıkamadan önce üç kez TBST ile nazikçe durulayın, her seferinde 5 dakika boyunca sürekli çalkalayın.
- İkincil Antikor inkübasyonu
- Bloke edici tampondaki ikincil antikoru seçilen konsantrasyonda (1: 1.000 ila 1: 50.000 arası) seyreltin ve 100 μL / kuyuyu 96 oyuklu bir plakaya veya bölüm 4.4.2'de açıklandığı gibi bir kutuya indirin ve daha sonra QDB plakasını yüklü 96 oyuklu plakanın veya kutunun içinde sürekli çalkalama altında RT'de 1 saat inkübe edin.
- QDB plakasını TBST ile 3 kez nazikçe durulayın, ardından plakayı sürekli çalkalayarak her biri TBST ile 5 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın.
- Miktar
- Üreticinin talimatlarını izleyerek gelişmiş kemilüminesans substratı (ECL) hazırlayın.
- ECL substratını 96 oyuklu bir plakaya (100 μL/oyuk) alın ve QDB plakasını sürekli çalkalama altında 2 dakika boyunca 96 oyuklu plakanın içine yerleştirin.
- QDB plakasını 96 oyuklu plakadan çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için kısa bir süre sallayın. Plakayı beyaz bir mikrotitre plakasına yerleştirin.
- Mikroplaka okuyucuyu açın ve birleşik plakaları (QDB plaka + beyaz plaka adaptörü) miktar belirleme için mikroplaka okuyucunun içine yerleştirmeden önce kullanıcı arayüzünde "kapaklı plaka"yı seçin.
NOT: Plakadan herhangi bir paraziti önlemek için beyaz, şeffaf olmayan mikro titre plakasını adaptör olarak kullandığınızdan emin olun. Birleştirilmiş plakalar (QDB plaka + 96 kuyulu plaka adaptörü) mikroplaka okuyucunun içine yerleştirildiğinde makinenin sıkışmasını önlemek için "kapaklı plaka" seçtiğinizden emin olun.
Tablo 1. Standart protein eğrisi için Seyreltme Şeması.
| S1
(0pg/μl) | S2 (33,3 pg/μl) | S3
(100 pg/μl) | S3
(300pg/μl) | S5
(600 pg/μl) | S6
(1200 sayfa/μl) |
| Standart protein (1200pg/μl) | 0 | 1,39 | 4,17 | 12,5 | 25 | 50 |
IgG içermeyen BSA
(4 sayfa/μl) | 50 | 48,61 | 45,83 | 37,5 | 25 | 0 |
| toplam | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tablo 2. Hazırlanan numuneler için Seyreltme Şeması
adet
| X1
(0μg/μl) | X2
(0,25μg/μl) | X3
(0.5μg/μl) | X4
(1μg/μl) | X5
(2μg/μl) | X6
(4 μg/μl) |
| Numune (4μg/μl) | 0 | 3.125 | 6,25 | 12,5 | 25 | 50 |
| IgG içermeyen BSA (4μg/μl) | 50 | 46.875 | 43,75 | 37,5 | 25 | 0 |
| toplam | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
