$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>NOT: Bu protokol, tekrarlanabilirliği artırmak için standartlaştırılmış, piyasada bulunan kitler ve reaktifler kullanılarak optimize edilmiştir (bkz.
1. Numunelerin hazırlanması
- Protein ekstraksiyonu
- -80 °C'den itibaren donmuş hücre veya doku örneklerini kuru buz üzerine aktarın, buz üzerinde çözdürün ve buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile gerektiği gibi yıkayın. Protein kalitesini etkileyeceği için gereksiz donma-çözülme döngülerinden kaçının.
- Her numuneye 1x proteaz inhibitörü içeren radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu (25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, %1 NP-40, %1 sodyum deoksikolat, %0.1 SDS) ekleyin, doku ağırlığı başına en uygun miktarı kullanarak.
not: Uygulamaya bağlı olarak, homojenizasyon tamponunun türü ve miktarı daha fazla optimizasyona ihtiyaç duyabilir.
- Doku örneklerini homojenize etmek için polipropilen tokmaklı el tipi bir elektrikli homojenizatör kullanın. Her numune arasında, havaneli çift damıtılmış suda yıkayın ve temiz bir doku ile kurulayın. Farklı deney koşulları ve dokular arasındaki havaneli değiştirin.
- Homojenizasyondan sonra numuneleri 10 dakika buz üzerinde bırakın. Numuneleri >10,000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı, peleti bozmadan buz üzerindeki yeni bir tüpe aktarın. Süpernatant, protein örneğidir. Ekstrakte edilen proteini -80 °C'de saklayın veya doğrudan protein konsantrasyonunu ölçmeye devam edin.
- Protein konsantrasyonunun miktar tayini ve normalizasyonu
- Bir bikinkoninik asit (BCA) testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün. Kuyucuk başına 200 μL BCA karışımı kullanarak 96 oyuklu bir optik plakada üreticinin talimatlarına göre bir BCA tahlil karışımı hazırlayın.
not: Lowry ve Bradford tahlilleri gibi diğer miktar tayin yöntemleri, protein konsantrasyonu deneyler arasında tutarlı bir şekilde ölçüldüğü sürece, protein konsantrasyonunu belirlemek için de kullanılabilir.
- Sığır serum albümini (BSA) standartlarını artan konsantrasyonlarda üçlü olarak hazırlayın ve her protein örneğinden 1 μL'yi iki kopya halinde ekleyin. Protein konsantrasyonunun düşük olması bekleniyorsa, 96 oyuklu plakayı önceden ısıtılmış bir ısı bloğunda 60 °C'de 10 dakika veya daha uzun süre inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, bir plaka okuyucu kullanarak emilimi 560 nm'de ölçün.
- Plaka okuyucu ölçümlerini dışa aktarın ve her bir numunenin ortalama absorbans değerlerini protein standardı kullanılarak elde edilen standart bir eğri ile karşılaştırarak protein konsantrasyonunu hesaplayın. Standart eğri için R-kare değeri, numune protein konsantrasyonunu doğru bir şekilde tahmin etmek için 0,98'e eşit veya daha büyük olmalıdır.
- Protein numunelerinin numune tamponunda ve ultra saf suda seyreltilmesini hazırlayarak protein miktarını normalleştirin. Kullanılan jel tipine bağlı olarak toplam hacim ayarlanabilir. Başlangıç miktarı olarak şerit başına 30 μg protein yüklenmesi önerilir. Her numuneye gerektiği gibi ditiotreitol (DTT; nihai konsantrasyon 5 mM) veya beta-merkaptoetanol (nihai konsantrasyon 200 mM) gibi bir indirgeyici madde ekleyin. Çeker ocakta seyreltilmemiş beta-merkaptoetanolü pipetleyin.
- Numuneleri 70 °C'de bir ısı bloğunda 10 dakika inkübe edin. Numuneleri buzun, girdabın üzerine koyun ve toplamak için kısa bir süre döndürün. Jeli yükleyene kadar buz üzerinde tutun.
2. Protein örneklerinin jel elektroforezi
- Cihaz ve jel kurulumu
- Jel elektroforez odası sisteminde prekast %4-12 Bis-Tris gradyan jeli (Malzeme Tablosuna bakınız) kurun. Kullanmadan önce jelleri çift damıtılmış su kullanarak durulayın.
NOT: İlgilenilen proteinin boyutuna, etkileşimlerine ve bolluğuna bağlı olarak, farklı bir gradyan, tamponlama maddesi veya kuyu boyutu ve sayısına sahip jeller kullanılabilir.
- Tank başına çift damıtılmış su ile seyreltilmiş 500 mL 1x MES SDS çalışma tamponu ekleyin. İstifleme jelindeki kuyucukları bozmadan, çalışan tamponu ekledikten sonra tarağı jellerden dikkatlice çıkarın.
- Protein yükleme
- Kuyuya 3,5 μL protein standardı yükleyin. Numune düzenine bağlı olarak, jelin her iki tarafına bir protein merdiveni yüklemek, protein boyutunun daha doğru bir şekilde tahmin edilmesine yardımcı olabilir. Daha doğru numune yüklemesi için ince uçlu jel yükleme uçları kullanın.
- Membranlar arası normalizasyon için dahili bir standart kullanırken (aşağıdaki 5. adıma ve tartışmaya bakın), protein merdiveninin yanındaki ilk 3 oyuğa diğer numunelere eşit bir miktar yükleyin.
- Kalan kuyucuklara her numuneden 30 μg yükleyin. Tüm boş kuyucuklara 1x numune tamponu ekleyin.
- elektroforez
- Numuneleri yükledikten sonra jel tankını monte edin. Numuneleri istifleme jeli boyunca 80 V'ta 10 dakika, ardından 150 V'ta 45-60 dakika daha çalıştırın.
3. Protein transferi
>NOT: Bu protokoldeki protein transferi, hızlı ve tutarlı sonuçlar için ticari olarak temin edilebilen yarı kuru bir kurutma sistemi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak gerçekleştirilir.
- Filtre kağıdını çift damıtılmış suya önceden batırarak ve jel bıçağının, plastik Pasteur pipetinin, kurutma silindirinin ve forsepsin kullanıma hazır olduğundan emin olarak protein transferini hazırlayın.
- Tüm sarma folyosunu dikkatlice çıkararak transfer yığınını açın. Üst kısmı alt yığından çıkarın ve bir kenara koyun. Alt yığındaki zarı birkaç damla elektroforez çalıştırma tamponu (2-3 mL) ile hızla nemlendirin. Transfer yığını açıldıktan sonra, PVDF membranının kurumasını önlemek önemlidir.
- Elektroforezi durdurduktan sonra, jel bıçağını kullanarak prekast jeli açın ve istifleme jelini kesin. Plastik dökümden kurtarmak için jeli kenarlarından kesin. Jelin zarar görmesini önlemek için jel bıçağını ıslak tutun.
- Aktarım yığınını aşağıdan yukarıya doğru birleştirin: alt yığın (PVDF membranını içeren), protein jeli ve filtre kağıdı. Tüm hava kabarcıklarını gidermek için kurutma silindirini kullanın. Üst yığını filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve hava kabarcıklarını gidermek için yığını tekrar yuvarlayın. Protein transferi sırasında jelin deforme olmasına neden olabileceğinden çok fazla itmeyin.
- Elektrot cihazın sol tarafında olacak şekilde tüm yığını transfer cihazına aktarın ve jel süngeri, cihazdaki ilgili elektrik kontakları ile hizalanacak şekilde yığının üzerine yerleştirin. Kapağı kapatın, seçin ve uygun programı başlatın (7 dakika boyunca 20 V önerilen bir başlangıç noktasıdır).
- Bittiğinde, yığının soğumasını sağlamak ve zarın kurumasını önlemek için kapağı 2 dakika kapalı bırakın. Transfer yığınını çıkarın ve zarı jel boyutuna kadar kesin. Toplam protein lekesine devam etmeden önce kesilen zarı çift damıtılmış suyla hızlı bir şekilde yıkayın.
4. Toplam protein boyama
>NOT: Floresan algılamanın kullanılması, doğrusal aralık ve hassasiyet çok daha iyi kontrol edilebildiğinden, daha geleneksel yaklaşımlara (örneğin, ECL algılama) göre önemli bir avantaj sağlar. Bu nedenle, 4. ve 5. adımlarda, floresan TPS ve floresan ikincil antikorlar kullanılır (bkz. Malzeme Tablosu).
- Membranı, protein tarafı içe bakacak şekilde 50 mL'lik bir tüpe yuvarlayın. Floresan TPS ve ikincil antikorların ışık hassasiyeti nedeniyle, sonraki tüm adımlar karanlıkta gerçekleştirilir.
- 5 mL protein lekesi çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir rulo üzerinde inkübe edin. TPS ve yıkama tamponu metanol içerdiğinden, bu adımları bir çeker ocakta gerçekleştirin.
- Boyama solüsyonunu atın ve 5 mL yıkama solüsyonu (%30 metanol içinde %6,3 asetik asit) ile iki kez hızlı bir şekilde yıkayın. Tüpü, yıkama adımları arasında kısa bir süre için silindire geri yerleştirin. Devam etmeden önce membranı ultra saf suyla kısa bir süre durulayın.
5. Blokaj, antikor inkübasyonu ve tespiti
- Membranın tıkanması: Membranı içeren 50 mL'lik tüpe 3 mL bloke edici tampon ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Membranı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir rulo üzerinde inkübe edin. Antikor seçimine bağlı olarak, kullanılan bloke edici tampon tipi optimizasyon gerektirebilir.
- Birincil antikor inkübasyonu
- Bloke edici tamponu atın ve uygun, optimize edilmiş konsantrasyonda birincil antikor ile değiştirin (Şekil 1 ve Şekil 2: fare-anti-SMN, 1: 1.000'de, bloke edici tamponda seyreltilmiş).
not: Primer antikorların yeterli optimizasyonu, antikorun diğer spesifik olmayan protein ürünlerine hiç bağlanma göstermezken veya minimum bağlanma gösterirken doğru boyutta bir protein ürünü tespit ettiğinin doğrulanmasını içermelidir. Mümkünse, ilgilenilen proteine karşı birden fazla antikoru test edin ve karşılaştırın.
- Membranı bir rulo üzerinde gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, antikor solüsyonunu çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) bir rulo üzerinde 1x PBS ile 5 dakika boyunca 6 kez yıkayın.
- İkincil antikor inkübasyonu
- Spesifik ikincil antikoru, 5 mL'lik bir bloke edici tamponda birincil antikorun konakçısına karşı 1: 5.000'de hazırlayın. Diğer ikincil antikorlar, diğer seyreltmeler veya alternatif bloke edici tamponların kullanılmasını gerektirebilir.
- Membranı ikincil antikor çözeltisi ile RT'de 1 saat boyunca bir silindir üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, zarı bir rulo üzerinde 1x PBS ile 30 dakika üç kez yıkayın.
- Membranı kurutun ve tespit edilene kadar alüminyum folyo kullanarak membranı ışıktan koruyun. Membranlar uzun süreli depolama için 4 °C'de tutulabilir.
- Görüntü elde etme
- Tarayıcıya bağlı bilgisayarda oturum açın. Membranı, protein tarafı aşağı bakacak şekilde tarayıcıya yerleştirin ve yazılımda tarama alanını seçin.
- Doygunluk oluşmadığını onaylayarak her iki (700 nm ve 800 nm) kanal için lazer yoğunluğunu optimize edin. Her iki kanaldaki görüntüleri alın ve daha fazla analiz için görüntüleri dışa aktarın (6. adım).
6. Western blot analizi ve miktar tayini
NOT: Bu öneriler, ücretsiz olarak sunulan Image Studio yazılımını temel alır. Bununla birlikte, ImageJ gibi diğer yazılım paketleri kullanılarak da karşılaştırılabilir analizler yapılabilir.
- Dosyayı içeri aktarın: Analiz için kullanılan bilgisayarda yerel bir çalışma alanı oluşturun. Bu, elde edilen batı lekeleri için bir görüntü dosyaları veritabanı oluşturur. Tarayıcıda elde edilen dosyaları içe aktarın ve analiz için görüntüyü seçin.
- TPS analizi
- Toplam protein boyama sonucunu göstermek için 700 nm kanalını görüntüleyin. Yenidoğan (P5) (Şekil 1A-B) ve 10 haftalık farelerden (Şekil 1C-D) alınan farklı dokuların doğrudan karşılaştırıldığı Şekil 1'de bir TPS görüntüsü örneği yer almaktadır. Benzer şekilde, Şekil 2, farklı yaşlardaki farelerden alınan beyin dokusunun doğrudan karşılaştırılmasının bir örneğini göstermektedir.
- Sağ üst köşeden Analiz sekmesini seçin ve normalleştirmenin ilgi alanını tanımlamak için Dikdörtgen Ekle'yi seçin (Şekil 1B, D). Tanımlanan bölgenin analiz edilen tüm şeritler için aynı boyutta olduğundan emin olmak için ilk dikdörtgen alanı kopyalayıp her bir numuneye yapıştırın.
- Sonucu, yazılımın sol alt köşesindeki Şekiller sekmesinden kopyalayın.
- Kantın<br />
not: Numunelerin miktarını belirlemek için en uygun yaklaşım, deneysel tasarıma bağlıdır. Burada, zamanla azaldığı bilinen hayatta kalma motor nöron proteininin (Smn; nöromüsküler hastalık spinal müsküler atrofisinde yer alan önemli bir protein) tespitine ve Smn sinyal yoğunluğunun TPS'ye normalleşmesinin protein ekspresyonu gelişiminin güvenilir tahminlerini nasıl sağladığına dair açıklayıcı bir örnek sunacağız.
- Şekil 2, protein yükleme kontrolü olarak TPS ile hayvanın yaşının artmasıyla birlikte Smn ekspresyonunun azaldığını göstermektedir. Protein yüklemesini ölçmek için Adım 6.2.1-6.2.3'ü tekrarlayın (Şekil 2B). İlgilenilen proteini analiz etmek için 800 nm kanalında (Şekil 2A) 6.2.1-6.2.3 Adımlarını tekrarlayın.
- Hem TPS'den hem de ilgilendiğiniz proteinden elde edilen sonuçları bir elektronik tablo programına kopyalayın. Elektronik tabloda, önce en yüksek TPS sinyalini belirleyerek ve normalleştirilmiş protein yükleme değerini elde etmek için her bir TPS sinyal değerini bu değere bölerek protein yüklemesini normalleştirin.
- Farklı numunelerdeki nispi protein ekspresyon oranını hesaplamak için her bir numuneden alınan 800 nm sinyal değerini, karşılık gelen normalleştirilmiş protein değerine bölün.
- İlk normalleştirmeden sonra, farklı zarlar ve deneyler arasında doğrudan karşılaştırmalara izin vermek için çeşitli zaman noktalarını veya dokuları dahili standardın ortalama değeriyle karşılaştırın.
