Hücre heterojenliğini belirlemek için tek hücreli western blotlama

Özet

Kaynak: Wang, L., et al., Monosit Kemotaktik Aktivitesinin İn Vivo Olarak Ölçülmesi ve Kan Monosit Türetilmiş Makrofajların Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019).

Video, heterojen bir süspansiyonda tek hücreli bir western blotlama çipi üzerinde yakalanan tek tek hücrelerin bileşimini tanımlayan tek hücreli bir western blotlama tekniğini açıklar. Teknik, hedef hücreye özgü bir protein markörüne etiketlenmiş floroforun floresan yoğunluğunu tespit eder.

Protokol

1. Tek Hücreli Western Blot (scWB) Analizi Kullanılarak Hücre Süspansiyonunda Hücre Kompozisyonunun Belirlenmesi

1. RT'de en az 10 dakika boyunca bir Petri kabında 15 mL 1x süspansiyon tamponunda kullanmadan önce scWB çipini yeniden sulandırın.
2. Yeniden sulandırılmış çipe 1 mL seyreltilmiş tek hücreli süspansiyon (10.000-100.000 hücre / mL) ekleyin. Yüzeyi 10 cm'lik bir Petri kabının dibine yerleştirin. Yüzeyin düz ayarlandığından emin olun.
3. Kurumasını önlemek için Petri kabını bir kapakla örtün ve hücrelerin bir gradyan ile 5-15 dakika oturmasına izin verin.
4. Çipi parlak alan mikroskobu altına yerleştirin ve kuyuları 10x büyütmede inceleyin.
   not: Mikro kuyuların yaklaşık% 15-20'si tek bir hücre tarafından işgal edilmeli ve kuyuların% 2'sinden azı 2 veya daha fazla hücre içermelidir.
5. Çipi içeren 10 cm'lik Petri kabını 45 derece eğin.
6. Çipin üstünden altına nazikçe pipetleme yaparak yakalanmamış hücreleri çipin yüzeyinden çıkarmak için çipi 1x süspansiyon tamponu ile yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
7. Tek hücreli Batı enstrümanını hazırlayın.
8. Lizis süresini, elektroforez süresini ve UV yakalama süresini ayarlayın. Bazal membrandan türetilmiş jel tıkacından geri kazanılan işe alınmış makrofajları analiz etmek için aşağıdaki ayarları kullanın: lizis süresi: 0 s; elektroforez süresi: 160 s; UV yakalama süresi 240 sn.
9. Çipi, jel tarafına bakan tek hücreli Western cihazının elektroforez hücresine dikkatlice yükleyin. Çipin jel tarafına zarar vermemek için dikkatli olun.
10. Lizis / çalışma tamponunu hazneye dökün ve tüm tek hücreli Western çipini tamamen kaplayın. Hücre lizizini başlatın.
11. 1.8'de listelenen ayarı kullanarak scWB cihazını çalıştırın.
12. Çalışma tamamlandıktan sonra, çipi 10 cm'lik bir Petri kabına aktarın ve çipi RT'de 10 dakika boyunca 1x yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
13. Toplam 80 μL antikor seyreltici hacminde birincil antikor dilüsyonlarını (anti-vinkülin: 1:10; anti-CD45: 1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80: 1:10) hazırlayın (8 μL antikor 1 artı 8 μL antikor 2 artı 64 μL seyreltici karıştırın).
14. Antikor problama odasına 80 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin ve antikor çözeltisi çip boyunca fitil olacak şekilde çip jel tarafını aşağı indirin.
15. RT'de 2 saat boyunca birincil antikor çözeltisi ile inkübe edin.
16. Çipi, çalkalayıcı üzerindeki 1x yıkama tamponunda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
17. Jeli tuzdan arındırmak için çipi çalkalayıcıdaki suda 10 dakika boyunca bir kez yıkayın.
18. Toplam 80 μL hacimde 1:20 oranında ikincil antikor seyreltmesi hazırlayın (2 μL ikincil antikor artı 78 μL seyreltici karıştırın).
19. Çipi, ışıktan korunan RT'de 1 saat boyunca ikincil bir antikor ile inkübe edin.
20. Çalkalayıcı üzerinde 1x yıkama tamponu ile çipi 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
21. Kalan yıkama tamponunu çıkarmak için bir sürgülü döndürücü kullanarak çipi döndürün.
22. Çipi, ikincil antikorlara bağlı floroforun spektral kanalında 5 μm çözünürlükte çift lazerli bir mikrodizi tarayıcıda tarayın.
23. ScWB'ye özel yazılım kullanarak verileri analiz edin.

2. scWB Çipinin Sıyrılması

1. Taranan çipi sıyırmaya hazır olana kadar bir yıkama tamponunda saklayın.
2. Su banyosunu bir davlumbazın içine yerleştirin.
3. Su rafın sadece 1 cm üzerinde olacak şekilde su banyosuna 50 mL'lik bir tüp rafı yerleştirin ve su sıcaklığını 60 °C'ye ayarlayın.
4. Sıyırma tamponunu hazırlayın. 1 L sıyırma tamponu çözeltisi için, 9.85 g Tris-HCl (pH 6.8) ve 20 g SDS'yi 900 mL damıtılmış suda çözün ve pH'ı ayarlayın. Daha sonra damıtılmış su ile 1L'ye kadar doldurun. Her kullanımdan hemen önce% 0.8 (h / h) β-merkaptoetanol (β-ME; 14.3 M) ekleyin.
5. İlk taramadan sonra, sıyırmadan önce çipi 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
6. Her çip için 40 mL sıyırma tamponu alın ve 320 μl β-ME.
   ekleyin DİKKAT: β-ME toksiktir ve insanlar ve çevre için tehlikelidir. Çeker ocakta aşağıdaki işlem yapılmalıdır.
7. Çipi teneke kutuya yerleştirin ve teneke kutuya su sızmasını önlemek için teneke kutuyu parafilm ile kapatın
8. Teneke kutuyu önceden ısıtılmış su banyosundaki tüp rafının içine yerleştirin.
9. 90 dakika inkübe edin.
10. Çipi teneke kutudan dikkatlice çıkarın ve taze bir Petri kabına yerleştirin.
11. Çipi 1x yıkama tamponu ile bir kez kısaca yıkayın. Daha sonra Petri kabına 15 mL 1x yıkama tamponu ekleyin.
12. Çipi bir çalkalayıcıda 15 dakika yıkayın. Yıkama adımını dört kez tekrarlayın.
    not: Chip bir sonraki primer antikor için hazırdır (bkz. adım 1.12 - 1.21)

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 cm Petri kabı	Griner Bio-Bir	664 160
10x süspansiyon tamponu	Proteinler Basit	R101
15 cm Petri kabı	doğan	353025
2-Merkaptoetanol	MP BIYOMEDIKAL	2194705
% 5 yıkama tamponu	Proteinler Basit	R252
Antikor seyreltici	Proteinler Basit	042-203
Tezgah Üstü Santrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.		Mikrofüj 22R Santrifüj
Sığır Serumu Albümini	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Calcein	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	C3099	1 mL
CD11b	Novus Biyolojikleri	NB110-89474
CD45 (D4H7K) tavşan mAb	Hücre Sinyal Teknolojileri	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus Biyolojikleri	NBP2-33337SS
Cellometer Vizyonu	Nexcelom
Dağıtma	Bd	354235	100 mL
Diseksiyon makası
Eşek anti-Tavşan IgG ikincil antikoru [NL557]	Novus Biyolojikleri	NL004	NL 557 eşlenik
Eşek anti-sıçan IgG (H + L) ikincil antikoru [DyLight 650]	Novus Biyolojikleri	NBP1-75655	DyLight 650 eşlenik
F4/80 (CI-A3-1)	Novus Biyolojikleri	NB600-404SS
Isı Bloğu	Efendi	22331	Termo karıştırıcı
Lizis/Çalışan arabellek	Proteinler Basit	R200
Matrigel Matrisi (Büyüme Faktörü Azaltılmış)	Bd	354230	10 ml
Mikrodizi tarayıcı	PerkinElmer	Tarama Dizisi Gx
Mikrosantrifüj tüpü	Balıkçı Bilimsel	05-408-129
mikroskop	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	Evos fl
Milo	Proteinler Basit		Tek hücreli batı
iğne	Bd	305111	26 gr
Parafilm Filmi
Prob odası	Proteinler Basit	035-020
Rekombinant fare CCL2 / JE / MCP-1 proteini	AR-GE	479-JE-050
scWEST çip	Proteinler Basit	C300
Shaker	Biyoekspres		Gen eşi orbital çalkalayıcı
Tek hücreli batı çip teneke kutu	Proteinler Basit	035-118
Slayt döndürücü	Labnet Ağı	C1303-T
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)	Balıkçı Bilimsel	BP 166-500
şırınga	Bd	309602	1 mL
Tris-Hidroklorür	Balıkçı Bilimsel	BP 153-500
cımbız	Proteinler Basit	035-020
Su banyosu	ThermoFisher (Termo Balıkçı)

Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi