Protein İşleme için Kemilüminesan Western Blot Testi

Özet

Kaynak: Hillert-Richter, L. K. et al., CD95 Ölüme Neden Olan Sinyal Kompleksinin Bileşiminin Ölçülmesi ve Bu Komplekste Procaspase-8'in İşlenmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, immünopresipite lizatların kemilüminesans bazlı western blotlamasını açıklamaktadır. Teknik, protein işleme ve aktivasyonunu belirlemeye yardımcı olur. Tespit edilen kemilüminesan sinyali, aktivasyonu sırasında protein işleme seviyesi ile orantılıdır.

Protokol

T hücresi deneyleri, 42502-2-1273 Uni MD etik anlaşmasına göre yapıldı.

1. Deney için hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu immünopresipitasyon için ortalama hücre sayısı 1 × 10^7'dir. Yapışık hücreler deneyden bir gün önce tohumlanmalıdır, böylece deney günü 1 × 10⁷ hücre olur.

1. Deney için yapışık hücrelerin hazırlanması
   1. Deney başlamadan bir gün önce 14,5 cm'lik tabaklarda her koşul için 20 mL ortamda 5-8 ×^{10 6} yapışkan hücre (bileşim için Malzeme Tablosuna bakınız)
   tohumlayın.
   2. Deney gününde, hücrelerin% 80-90 oranında birleştiğinden ve....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 12,5 SDS jel	Kendi kendine yapılan		İki ayırıcı jel için: 3,28 mL damıtılmış H2O 2,5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL akrilamid 100 ve mikro; L% 10 SDS 100 ve mikro; L% 10 APS 7.5 ve mikro; L İki toplama jeli için TEMED: 3.1 mL damıtılmış H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1,5 M 0,5 mL akrilamid 50 ve mikro; L% 10 SDS 25 ve mikro; L% 10 APS 7.5 ve mikro; L TEMED
14,5 cm hücre tabakları	Greiner	639160
Akrilamid	Carl Roth	A124.1
Yüksek geri kazanım filtreli ve geniş delikli aerosol filtreli pipet uçları	VWR	46620-664 (Kuzey Amerika) veya 732-0559 (Avrupa)	Boncukları lizata pipetlemek için kullanılır
lizata pipetlemek için kullanılır	Sigma Aldrich	A2103	Seyreltme: PBST'de 1:4000 + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZO	ALX-805-038-C100	immünopresipitasyon
anti-kaspaz-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Seyreltme: PBST'de 1:1000 + 1:100 NaN3
anti-kaspaz-3 Ab	Hücre sinyalizasyonu	9662 S	Seyreltme: PBST'de 1:2000 + 1:100 NaN3
anti-kaspaz-8 Ab C15	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZO	ALX-804-242-C100	Seyreltme: PBST'de 1:20 + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Seyreltme: PBST'de 1:2000 + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZO	ALX-804-961-0100	Seyreltme: PBST'de 1:10 + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZO	ADI-AAM-212-E	Seyreltme: PBST'de 1:10 + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	Hücre sinyalizasyonu	9542	Seyreltme: PBST'de 1:1000 + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-merkaptoetanol	Carl Roth	4227.2
Bradford çözeltisi Protein Tahlili Boya Reaktif Konsantresi 450ml	Bio Rad	500-0006	Üreticinin talimatlarına göre kullanılır
CD95L	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya satın alınabilir ENZO	ALX-522-020-C005
tarafından Kemilüminesans dedektörü Chem Doc XRS+	Bio Rad
Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyli (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır
DPBS (10x) Ca, Mg	PAN olmadan Biotech	P04-53500	H2O ile 1:10 seyreltme, buzdolabında saklama
Elektroforez tamponu	Kendi kendine yapılan		10x elektroforez tamponu: 60.6 g Tris 288 g glisin 20 g SDS ad 2 L H2O kullanımdan önce 1:10 seyreltme
Glisin	Carl Roth	3908.3
Keçi Anti-Fare IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	Seyreltme 1:10.000 PBST + %5 süt
Keçi Anti-Fare IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Seyreltme 1:10.000 PBST + %5 süt
Keçi Anti-Tavşan IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Seyreltme 1:10.000 PBST + %5 süt
İnterlökin-2 İnsan (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	T hücrelerinin aktivasyonu için
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
Yükleme tamponu 4x Laemmli Numune Tamponu, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır
Luminata Forte Western HRP substrat	Millipore	WBLUFO500
Lysis tamponu	Kendi kendine yapılan		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1,5 m 27,5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100, yapışık hücreler için 960 mL H2O
Ortamı ekler DMEM F12 (1:1) w kararlı Glutamin, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	ortama %10 FCS, %1 Penisilin-Streptomisin ve %0.0001 Puromycin eklenmesi
	gibco by Life Technologie	21875034	Ortama %10 FCS ve %1 Penisilin-Streptomisin eklenmesi
Süt tozu	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Kendi kendine yapılan		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Telif hakkı ve kopya; 2021 JoVE Dergisi Görselleştirilmiş Deneyler jove.com Sayfa 3 / 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O seyreltme kullanımdan önce 1:20
PBST + %5 süt	Kendi kendine yapılan		50 g süt tozu + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	T Hücrelerinin aktivasyonu için
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standardı All Blue	Bio Rad	161-0373	3-5 & mikro arasında kullanın; L
Protein A Sefaroz CL-4B boncuklar	Novodirect / Th.Geyer	GE 17-0780-01	Üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış afinite reçine boncukları
Sıyırıcı	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Çalkalayıcı	Heidolph
Sodyum azid	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini boyutlu transfer yığınları	Bio Rad	170-4270	Üreticinin talimatlarına göre kullanılır
TransBlot Turbo 5x Transfer Tamponu	Bio Rad	10026938	Üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır
TransBlot Turbo Mini boyutlu niktroselüloz membran	Bio Rad	170-4270	Üreticinin talimatlarına göre kullanılır
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000

Boncukları tarafından satın alınabilir. Sadece için kullanılır tarafından satın alınabilir tarafından satın alınabilir tarafından satın alınabilir Primer T hücreleri için