Protein İşleme için Kemilüminesan Western Blot Testi

Özet

Kaynak: Hillert-Richter, L. K. et al., CD95 Ölüme Neden Olan Sinyal Kompleksinin Bileşiminin Ölçülmesi ve Bu Komplekste Procaspase-8'in İşlenmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, immünopresipite lizatların kemilüminesans bazlı western blotlamasını açıklamaktadır. Teknik, protein işleme ve aktivasyonunu belirlemeye yardımcı olur. Tespit edilen kemilüminesan sinyali, aktivasyonu sırasında protein işleme seviyesi ile orantılıdır.

Protokol

T hücresi deneyleri, 42502-2-1273 Uni MD etik anlaşmasına göre yapıldı.

1. Deney için hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu immünopresipitasyon için ortalama hücre sayısı 1 × 10^7'dir. Yapışık hücreler deneyden bir gün önce tohumlanmalıdır, böylece deney günü 1 × 10⁷ hücre olur.

1. Deney için yapışık hücrelerin hazırlanması
   1. Deney başlamadan bir gün önce 14,5 cm'lik tabaklarda her koşul için 20 mL ortamda 5-8 ×^{10 6} yapışkan hücre (bileşim için Malzeme Tablosuna bakınız)
   tohumlayın.
   2. Deney gününde, hücrelerin% 80-90 oranında birleştiğinden ve tabağa yapıştığından emin olun. Ortamı atın ve yapışan hücrelere taze ortam ekleyin.
2. Deney için süspansiyon hücrelerinin hazırlanması
   1. Deney başlamadan hemen önce 14,5 cm'lik tabaklara koşul başına 10 mL kültür ortamına (bileşim için Malzeme Tablosuna bakınız) 1 ×^{10 7} süspansiyon hücresini dikkatlice yerleştirin.
   2. Birincil hücreler kullanılıyorsa, birincil T hücrelerini daha önce açıklanan prosedüre göre izole edin. Birincil T hücrelerini 24 saat boyunca 1 μg / mL fitohemaglutinin ile tedavi edin, ardından 6 gün boyunca 25 U / mL IL2 tedavisi uygulayın.
   3. Deney başlamadan hemen önce 14,5 cm'lik tabaklarda koşul başına 1 × 10 8 birincil T hücresini 10 mL kültür ortamına (bileşim için Malzeme Tablosuna bakınız) dikkatlice yerleştirin.
      not: Bu hücreler daha küçük olduğu için bu daha yüksek sayıda birincil T hücresi önerilir.

2. CD95L stimülasyonu

1. Hücreleri CD95L ile uyarın (daha önce açıklandığı gibi üretilir veya ticari olarak temin edilebilir (Malzeme Tablosuna bakınız).
   not: CD95L'nin konsantrasyonu ve stimülasyon süresi hücre tipine bağlıdır. Paralel olarak bir 'boncuk kontrolü' numunesi oluşturmak için bir stimülasyon koşulunu iki kez hazırlayın.
   1. Seçilen CD95L konsantrasyonu ile yapışan hücreleri uyarın. Plakayı belirli bir açıyla tutun ve yapışık hücrelere dokunmadan ligandı ortama pipetleyin.
   2. Ligand çözeltisini hücre süspansiyonuna pipetleyerek süspansiyon hücrelerini CD95L ile uyarın.

3. Hücre hasadı ve parçalanması

1. Hücre kaplarını buzun üzerine yerleştirin.
   not: Ortamı atmayın. Ölmekte olan hücreler ortamda yüzer ve analiz için önemlidir.
2. Hücre süspansiyonuna 10 mL soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve bağlı hücreleri plakadan kazıyın. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
3. Hücre kabını 10 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve yıkama solüsyonunu aynı 50 mL'lik tüpe yerleştirin. Hücre süspansiyonunu 5 dakika, 4 ° C boyunca 500 × g'da santrifüjleyin.
4. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL soğuk PBS ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
5. Hücre süspansiyonunu 5 dakika, 4 ° C boyunca 500 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL soğuk PBS ile yeniden süspanse edin.
6. Hücre süspansiyonunu 5 × g'da 5 dakika, 4 ° C santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL lizis tamponu (% 4 proteaz inhibitörü kokteyli içeren) ile yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
7. Lizatı maksimum hızda (~ 17.000 × g) 15 dakika, 4 ° C santrifüjleyin.
8. Süpernatanı (lizat) temiz bir tüpe aktarın. Peleti atın. Başka bir tüpte 50 μL lizat alın. Protein konsantrasyonunu Bradford testi ile analiz edin ve bir şişede 25 μg proteine karşılık gelen lizat miktarını alın. Şişeye yükleme tamponu ekleyin (bileşim için Malzeme Tablosuna bakın). Lizat kontrolü olarak -20 °C'de saklayınız.

4. İmmünopresipitasyon (IP)

1. Lizata 2 μL anti-APO-1 antikoru ve 10 μL protein A sefaroz boncuğu (üretici tarafından önerildiği şekilde hazırlanır) ekleyin. Bir 'boncuk kontrolü' oluşturmak için lizat (uyarılmış numune) içeren ayrı bir tüpe sadece 10 μL boncuk ekleyin.
   not: Protein A sefaroz boncuklarını tutarken uçları keserek veya IP için özel uçlar satın alarak geniş delikli pipet uçları kullanın.
2. Lizat karışımını antikorlar/protein A sefaroz boncukları ile gece boyunca 4 ° C'de nazikçe karıştırarak inkübe edin. Lizatları antikorlar/protein A sefaroz boncukları ile 500 × g'da 4 dakika, 4 ° C santrifüjleyin. Süpernatanı atın, boncuklara 1 mL soğuk PBS ekleyin ve bu adımı en az üç kez tekrarlayın.
3. Süpernatanı atın. Boncukları tercihen 50 μL'lik bir Hamilton şırınga ile aspire edin.

5. Batı lekesi

1. Boncuklara 20 μL 4x yükleme tamponu ekleyin (bileşim için Malzeme Tablosuna bakın) ve 95 °C'de 10 dakika ısıtın. Lizat kontrollerini 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
2. Lizatları, IP'leri ve bir protein standardını %12,5 sodyum dodesil sülfat (SDS) jel üzerine yükleyin (jel hazırlığı için Malzeme Tablosuna bakın) ve 80 V'luk sabit bir voltajla çalıştırın.
3. Proteinleri SDS jelinden bir nitroselüloz membrana aktarın.
   not: Burada, ilgilenilen proteinler için optimize edilmiş yarı kuru teknik, 12 dakika boyunca transfer için kullanıldı (25 V; 2.5 A = sabit). Nitroselüloz membranı ve iki mini boyutlu transfer yığınını elektroforez tamponunda bekletin (bileşim için Malzeme Tablosuna bakın, üreticinin talimatlarına göre hazırlayın) batı lekelemeden önce birkaç dakika
.
4. Lekeli membranı bir kutuya yerleştirin ve bir bloke edici solüsyonda 1 saat bloke edin (PBS'de %0.1 Tween-20 (PBST) + %5 süt). Membranı hafif çalkalama altında bloke edici çözelti ile inkübe edin.
5. Membranı her yıkamada 5 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.

6. Western leke tespiti

1. Belirtilen seyreltmede ilk birincil antikoru (Malzeme Tablosuna bakınız) zara ekleyin ve hafif çalkalama ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
2. Membranı her yıkamada 5 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.
3. Membranı 20 mL ikincil antikor (PBST +% 5 sütte 1: 10.000 seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 1 saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
4. Membranı her yıkamada 5 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.
5. PBST'yi atın ve zara yaklaşık 1 mL yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin.
6. Kemilüminesan sinyalini tespit edin (Malzeme Tablosuna bakın).
   not: Maruz kalma süresi ve yakalanan görüntülerin sayısı, hücredeki protein miktarına ve kullanılan antikorların özgüllüğüne bağlıdır. Tespit için kullanılan her antikor için ampirik olarak belirlenmelidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 12,5 SDS jel	Kendi kendine yapılan		İki ayırıcı jel için: 3,28 mL damıtılmış H2O 2,5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL akrilamid 100 ve mikro; L% 10 SDS 100 ve mikro; L% 10 APS 7.5 ve mikro; L İki toplama jeli için TEMED: 3.1 mL damıtılmış H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1,5 M 0,5 mL akrilamid 50 ve mikro; L% 10 SDS 25 ve mikro; L% 10 APS 7.5 ve mikro; L TEMED
14,5 cm hücre tabakları	Greiner	639160
Akrilamid	Carl Roth	A124.1
Yüksek geri kazanım filtreli ve geniş delikli aerosol filtreli pipet uçları	VWR	46620-664 (Kuzey Amerika) veya 732-0559 (Avrupa)	Boncukları lizata pipetlemek için kullanılır
lizata pipetlemek için kullanılır	Sigma Aldrich	A2103	Seyreltme: PBST'de 1:4000 + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZO	ALX-805-038-C100	immünopresipitasyon
anti-kaspaz-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Seyreltme: PBST'de 1:1000 + 1:100 NaN3
anti-kaspaz-3 Ab	Hücre sinyalizasyonu	9662 S	Seyreltme: PBST'de 1:2000 + 1:100 NaN3
anti-kaspaz-8 Ab C15	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZO	ALX-804-242-C100	Seyreltme: PBST'de 1:20 + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Seyreltme: PBST'de 1:2000 + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZO	ALX-804-961-0100	Seyreltme: PBST'de 1:10 + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZO	ADI-AAM-212-E	Seyreltme: PBST'de 1:10 + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	Hücre sinyalizasyonu	9542	Seyreltme: PBST'de 1:1000 + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-merkaptoetanol	Carl Roth	4227.2
Bradford çözeltisi Protein Tahlili Boya Reaktif Konsantresi 450ml	Bio Rad	500-0006	Üreticinin talimatlarına göre kullanılır
CD95L	Bu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya satın alınabilir ENZO	ALX-522-020-C005
tarafından Kemilüminesans dedektörü Chem Doc XRS+	Bio Rad
Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyli (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır
DPBS (10x) Ca, Mg	PAN olmadan Biotech	P04-53500	H2O ile 1:10 seyreltme, buzdolabında saklama
Elektroforez tamponu	Kendi kendine yapılan		10x elektroforez tamponu: 60.6 g Tris 288 g glisin 20 g SDS ad 2 L H2O kullanımdan önce 1:10 seyreltme
Glisin	Carl Roth	3908.3
Keçi Anti-Fare IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	Seyreltme 1:10.000 PBST + %5 süt
Keçi Anti-Fare IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Seyreltme 1:10.000 PBST + %5 süt
Keçi Anti-Tavşan IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Seyreltme 1:10.000 PBST + %5 süt
İnterlökin-2 İnsan (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	T hücrelerinin aktivasyonu için
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
Yükleme tamponu 4x Laemmli Numune Tamponu, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır
Luminata Forte Western HRP substrat	Millipore	WBLUFO500
Lysis tamponu	Kendi kendine yapılan		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1,5 m 27,5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100, yapışık hücreler için 960 mL H2O
Ortamı ekler DMEM F12 (1:1) w kararlı Glutamin, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	ortama %10 FCS, %1 Penisilin-Streptomisin ve %0.0001 Puromycin eklenmesi
	gibco by Life Technologie	21875034	Ortama %10 FCS ve %1 Penisilin-Streptomisin eklenmesi
Süt tozu	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Kendi kendine yapılan		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Telif hakkı ve kopya; 2021 JoVE Dergisi Görselleştirilmiş Deneyler jove.com Sayfa 3 / 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O seyreltme kullanımdan önce 1:20
PBST + %5 süt	Kendi kendine yapılan		50 g süt tozu + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	T Hücrelerinin aktivasyonu için
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standardı All Blue	Bio Rad	161-0373	3-5 & mikro arasında kullanın; L
Protein A Sefaroz CL-4B boncuklar	Novodirect / Th.Geyer	GE 17-0780-01	Üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış afinite reçine boncukları
Sıyırıcı	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Çalkalayıcı	Heidolph
Sodyum azid	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini boyutlu transfer yığınları	Bio Rad	170-4270	Üreticinin talimatlarına göre kullanılır
TransBlot Turbo 5x Transfer Tamponu	Bio Rad	10026938	Üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır
TransBlot Turbo Mini boyutlu niktroselüloz membran	Bio Rad	170-4270	Üreticinin talimatlarına göre kullanılır
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000

Boncukları tarafından satın alınabilir. Sadece için kullanılır tarafından satın alınabilir tarafından satın alınabilir tarafından satın alınabilir Primer T hücreleri için