Bitki dokusunun toplam RNA ekstraktındaki spesifik mikroRNA'yı tespit etmek ve ölçmek için Northern Blot

Özet

Kaynak: Tirumalai, V., et al. Bitki MikroRNA'larının Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi için RNA Blot Analizi. J. Vis. Exp. (2020)

Bu videoda, bitki dokusundan ekstrakte edilen toplam RNA'dan mikroRNA'ları (miRNA'lar) tespit etmek ve ölçmek için bir hibridizasyon tekniği olan kuzey blotunu gösteriyoruz.

Protokol

1. Jel elektroforezi

1. Ön çalışmayı durdurun ve numune yüklemeden önce kuyucukları yıkayın.
2. Numuneleri 98 °C'de 1 dakika ısıtın ve numuneleri kılcal uçlar kullanarak sıcak olarak kuyuya yükleyin. Ucu kuyunun dibine yerleştirin, böylece numune kuyucukta ince bir tabaka kaplar.
3. Tüm numunelerin eksiksiz yüklenmesi. RNA on yıl işaretleyicisinin yüklenmesini içerir.
4. Bromofenol mavisi boya neredeyse tamamen akana kadar jeli 80 V'ta çalıştırın. Bromofenol mavisi, %15 denatüre edici akrilamid jelde 10 bp'de çalışır.

2. Elektro-lekeleme için hazırlık

1. N+naylon membranı bir cam plaka boyutlarında kesin ve membranı sağ üst köşesinden bir HB kalemle etiketleyin.
2. Membranı, etiketli tarafı su yüzeyine bakacak şekilde steril su yüzeyine nazikçe yerleştirin. Membranı 15 dakika önceden ıslatın.
3. 4 adet kurutma kağıdı I'i fiber ped boyutlarında kesin.
4. Kasetin gri tarafını temiz bir tepsiye yerleştirerek jel sandviçi hazırlayın.
5. Fiber pedi önceden ıslatın ve kasetin üzerine yerleştirin. Hava kabarcıklarını çıkarın.
6. Bir parça kurutma kağıdını 1x TBE'de önceden ıslatın ve fiber pedin üzerine yerleştirin. Kağıdın üzerine plastik bir pipet sararak hava kabarcıklarını çıkarın. Başka bir parça önceden ıslatılmış kurutma kağıdı yerleştirin ve hava kabarcıklarını çıkarın.
7. Jeli çalışan kasetten dikkatlice çıkarın ve ilk yüklenen RNA örneği sağa doğru olacak şekilde sandviç kurulumunun üzerine yerleştirin.
8. Önceden ıslatılmış zarı yavaşça 1x TBE'ye batırın ve etiketli tarafı aşağı bakacak şekilde jelin üzerine yerleştirin. Hava kabarcıklarını gidermek için açın.
9. Bir parça kurutma kağıdını batırın, zarın üzerine koyun ve hava kabarcıklarını çıkarın. Başka bir kurutma kağıdı batırın, sandviç kurulumunun üzerine yerleştirin ve hava kabarcıklarını çıkarın.
10. Kurulumun üzerine önceden ıslatılmış bir fiber ped yerleştirerek ve kaseti sıkıca kapatarak sandviçi tamamlayın.
11. Transblot kasetini modüle yerleştirin ve lekeleme işaretine kadar 1x TBE, pH 8.2 doldurun.
12. 10 V'ta, gece boyunca 4 °C'de aktarın.
13. Transferden sonra, nemli zarı bir kağıt kağıda yerleştirin ve 254 nm UV ışığı (120.000 μjoule/cm²) ile ışınlayarak RNA'yı hemen zara çapraz bağlayın. Çapraz bağlı leke, daha fazla hibridizasyon için 4 °C'de saklanabilir.

3. Radyoaktif işaretli probun hazırlanması

1. Tespit edilecek küçük RNA'yı tamamen tamamlayan bir prob tasarlayın.
2. Bileşenleri Tablo 32'de verilen tarife göre birleştirerek 5' ucunda ƳP1ATP (BRIT'ten elde edilen) kullanarak probu sonlandırın.
3. Yukarıdaki reaksiyon karışımını 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
4. Üreticinin protokolüne göre bir Sephadex G-25 sütunu kullanarak etiketlenmemiş ƳP32ATP'yi probdan ayırın.

4.Lekenin hibridizasyonu

1. Çapraz bağlı lekeyi, RNA tarafı üste bakacak şekilde bir hibridizasyon şişesinin içine yerleştirin.
2. Ultra hassas hibridizasyon tamponunu kuvvetlice karıştırın, 10 mL ekleyin ve lekeyi 35 °C'de tutulmuş bir hibridizasyon fırını içinde rotasyonla inkübe edin.
3. 20 dakika boyunca ön hibridizasyon yapın.
4. Şişeyi fırından çıkarın ve etiketli probu nazikçe hibridizasyon tamponuna ekleyin.
5. Lekeyi 35 °C'de, 12 saat döndürerek hibritleştirin.
6. Hibridizasyondan sonra, hibridizasyon çözeltisini dikkatlice 15 mL'lik tüpe aktarın. Bu çözelti yeniden kullanılana kadar 4 °C'de saklanabilir.
7. 2x SSC tamponu artı %0,5 SDS ekleyerek fazla hibridizasyon solüsyonunu çıkarmak için lekeyi 2 dakika hızlı bir şekilde yıkayın. Çözümü atın.
8. Lekeyi 2x SSC tamponu artı 35 ° C'ye% 0.5 SDS ile 30 dakika döndürerek inkübe edin.
9. Lekeyi 0,5x SSC tamponu artı 35°C'de %0,5 SDS ile 30 dakika döndürerek tekrar yıkayın.
10. Lekeyi bir hibridizasyon kapağının içine yerleştirin, fazla tamponu çıkarın ve kapatın.
11. Gece boyunca bir kasetin içinde radyasyon içermeyen fosforlu bir görüntüleyici ekranına maruz bırakın.
12. Bir biyomoleküler görüntüleyici kullanarak hibridizasyon sinyalini tespit edin ve uygun yazılımı kullanarak sonuçları analiz edin.

Tablo 1: Tarifler Tablosu

Tampon ve çözelti	yemek tarifi	Yorum
10 X TBE	0.89M Tris tamponu	pH, asetik asit kullanılarak 8.2'ye ayarlanmalıdır
	0.89M Borik asit
	30 milyon EDTA
Jel karışımı	%15 akrilamid-bisakrilamid sol, 19:1	Jel karışımı üre kristalleri içermemelidir
	8M üre
	1 KAT TBE
Jel yükleme boyası	0.05 %(a/h) Bromofenol Mavisi	Deiyonize formamid ile çalışırken dikkatli olunmalıdır
	0.05% (a/h) Ksilen ksiyanol
	% 100 deiyonize - formamid
Probun etiketlenmesi	PNK tamponu (10X, 2 μL)	Bu karışım radyoaktif moleküller içerir, bu adım bir radyoaktif laboratuvarında eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmelidir.
	PNK enzimi (1 μL)
	Oligo (100 μM, 0.1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Yıkama Tamponu - I	2 kat SSC
	%0,5 (a/h) SDS
Yıkama Tamponu - II	0,5 kat SSC
	%0,5 (a/h) SDS
Sıyırma Tamponu - I	0,5 kat SSC
	%0,1 (a/h) SDS
Sıyırma Tamponu - II	0.1X SSC
	%0,1 (a/h) SDS

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 40 Akrilamid-bisakrilamid çözeltisi	Sigma	A9926	kimyasal
Amonyum persülfat (APS)	BioRad (BiyoRad	1610700	kimyasal
Kurutma kağıdı	Whatman kurutma kağıdı I	1001-125	Tahlil
Bromofenol mavisi	Sigma	B5525-5G	kimyasal
Kılcal yükleme ipuçları	BioRad (BiyoRad	2239915	Plastik eşya
Deiyonize formamid	Ambion Teknolojisi	AM9342	kimyasal
Isıtma bloğu	Eppendorf Belediyesi	5350	aygıt
Hybond N+naylon membran	Ge	RPN203B	Tahlil
Hibridizasyon şişesi	Sigma	Z374792-1 adet	Plastik eşya
Hibridizasyon Fırını	Termo Bilimsel	1211V79	aygıt
N,N,N',N'- Tetrametiletilendiamin (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	kimyasal
Fosfor Görüntüleyici	GE- Typhoon tarayıcı	29187194	aygıt
PhosphorImager ekran ve kaset	GE sağlık hizmetleri	GE28-9564-75	aygıt
Pipetler	Gilson, modeller: P20 ve P10	FA10002M, FA10003M	Plastik eşya
Plastik pipet	doğan	357550	Plastik eşya
Poliakrilamid jel aparatı	BioRad (BiyoRad	1658003EDU	aygıt
Sephadex G-25 sütunu	GE sağlık hizmetleri	27532501	aygıt
Hız Vac Konsantratörü	Termo Bilimsel	20-548-130	aygıt
Çark	Tarsonlar	1010	aygıt
T4 Polinükleotid Kinaz (PNK)	NEB (Türkçe)	M0201S Serisi	Tahlil
Transblot aparatı	BioRad (BiyoRad	1703946	aygıt
ULTRAHyb hibridizasyon tamponu	Ambion Teknolojisi	AM8670	Tahlil
üre	Fischer Bilimsel	15985	kimyasal
UV çapraz bağlayıcı	UVP (Nükleer Enerji)	CL-1000L	aygıt
girdap	Tarsonlar	3020	aygıt
Su banyosu	NEOLAB (NEOLAB)	D-8810	aygıt
Ksilen siyanol	Sigma	X4126-10G	Tahlil

Serisi ) ) Serisi Adet Serisi ) ) Serisi Yılı Serisi