Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Özet

Kaynak: Henty-Ridilla, J.L., Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile İn Vitro Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirme. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Protokol

1. Lamelleri yıkamak

NOT: (24 mm x 60 mm, #1.5) lameller Smith ve ark., 2013'e göre yıkayın.

1. Lamelleri plastik bir sürgülü posta kabına yerleştirin.
2. Lamelleri aşağıdaki solüsyonlara sırayla batırın ve 30-60 dakika boyunca sonikasyon yapın, her solüsyon arasında 10 kez ddH₂O ile durulayın: bir damla bulaşık deterjanı ile ddH₂O; 0.1 M KOH. Lamelleri 6 aya kadar 0 etanolde saklayın.
   not: Sevilmeyen parmaklarla cam yüzeylere dokunmayın. Bunun yerine forseps kullanın.

2. Temizlenmiş (24 mm x 60 mm, #1.5) lamellerin mPEG ve biotin-PEG-silan ile kaplanması

>NOT: Bu protokol, aktin ve mikrotübülleri TIRF görüntüleme düzlemi içinde konumlandırmak için özel olarak bir biyotin-streptavidin sistemi kullanır. Diğer kaplamalar ve sistemler kullanılabilir (örneğin, antikorlar, poli-L-lizin, NEM miyozin, vb.).

1. PEG-silan ve biotin-PEG-silan tozlarının alikotlarını çözün.
2. 
   
   
4. 
   
5. 
   

1. 
   
6. 
   
7. 
   

1. 4. 
      
   5. 
      

2. 2. 
      

1. 1. 2. 
   3. 
      
2. 1. 2. 
      3. 
         
      4. 
         
   3. 
      
3. 2. 
      

4. 
   

Sonuçlar

Şekil 1. Deneysel şemalar: görüntü elde etmek için akış odası montajı. (A) Görüntüleme odası montajı. Yukarıdan aşağıya: IBIDI görüntüleme odaları perfüzyon kuyuları boyunca bantlanır (okla gösterilir); ikinci (beyaz) bant destek tabakası (kullanıcıları daha iyi yönlendirmek için gösterilen resimde açık bırakılmıştır) çıkarılır ve perfüzyon odasının kenarına Epoksi uygulanır (ok). Not: Kullanıcıları epoksiyi nereye y...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%1 BSA (a/h)	Balıkçı Bilimsel	BP1600-100	Bu amaçla (TIRF odalarının bloke edilmesi), BSA ddH20'de yeniden süspanse edilir ve 0.22 μm'lik bir filtreden süzülür.
1× BRB80	Ev yapımı		80 mM BORULAR, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, KOH ile pH 6.8
80 mM BORULAR, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, KOH ile pH 6.8	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	G2133-50KU	Katalaz ile birleştirilir, alikot ve kullanıma kadar -80 oC'de saklanır
100 μM tübülin	Hücre İskeleti A.Ş., Denver, CO	T240	Ev yapımı tübülinler, polimerizasyona yetersiz tübülini çıkarmak için kullanılmadan önce geri dönüştürülmelidir (Hyman ve ark. (1992)29; Li ve Moore (2020)30). Ticari olarak temin edilebilen tübülinler genellikle geri dönüştürülemeyecek kadar seyreltiktir, ancak üreticinin talimatlarına göre yeniden süspanse edilirse ve kullanımdan önce 60 dakika boyunca ultrasantrifüj (278.000 × g) yoluyla önceden temizlenirse iyi çalışır.
100 mM ATP	Altın Biyoteknoloji A.Ş., Olivette, MO	A-08	ddH20'de (pH 7.5) yeniden süspanse edildi ve filtre sterilize edildi.
100 mM GTP	Balıkçı Bilimsel	AC226250010	1× BRB80 (pH 6.8) içinde yeniden süspanse edildi ve filtre sterilize edildi.
120-150 mW katı hal lazerleri	Leica Mikro Sistemler	11889151; 11889148
2 mg/mL katalaz	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	C40-100	Glikoz oksidaz ile birleştirilir, alikot ve kullanıma kadar -80 oC'de saklanır
2× TIRF tamponu	Ev delisi		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glikoz, %0,5 (h/h) metilselüloz (4.000 cp); Not: Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için 1 μL 0.1M GTP ve 1 μL 0.1M ATP TIRF reaksiyonlarına ayrı olarak eklenir.
24 × 60 mm, #1.5 kapak camı	Fisher Bilimsel, Waltham, MA	22-266882	Coverglass kullanılmadan önce yoğun bir şekilde yıkanmalıdır (Smith ve ark. (2014)22 )
37 oC ısı bloğu
37 oC su banyosu
5 mg/mL Streptavidin (600x stok)	Avantor, Philadelphia, Pensilvanya	RLS000-01	Tris-HCl'de (pH 8.8) yeniden süspanse edilir; alikotu kullanım gününde HEK tamponunda ×1'e kadar seyreltin
5 dk Epoksi reçine ve sertleştirici	Loctite, Kayalık Tepe, CT	1365736	Kombine reçine ve sertleştiricinin kürlenmesi 30 dakika kadar sürebilir.
%50 biyotinillenmiş-GpCpp mikrotübül tohumları	Hücre İskeleti A.Ş; Ev yapımı	T333P	(isteğe bağlı) GppCpp veya Taxol stabilize mikrotübül tohumları, mikrotübül polimerizasyonuna daha verimli bir şekilde aracılık edebilir. Taxol ve GppCpp, mikrotübül kafes yapısını ve belirli düzenleyici proteinlerin mikrotübülün stabilize edilmiş kısmına bağlanma yeteneğini etkileyebilecek farklı şekillerde mikrotübülleri stabilize eder. Çeşitli mikrotübül tohumları yapmak için bir yöntem Hyman ve ark. (1992).
70 C kuluçka makinesi
Aktin karışım stoğu	Ev yapımı; bu protokol		Altı reaksiyona kadar etiketli (floresan ve biyotinillenmiş) ve etiketsiz aktinden oluşan 12.5 μM'lik bir aktin karışımı. Son TIRF reaksiyonunda 2 μL stok kullanılır. Her reaksiyonda kullanılan nihai aktin konsantrasyonu 0.5 μM'dir (%10 Alexa-647; %0.09 biyotin etiketli).
Uygun tampon kontrolleri	Ev yapımı		Değerlendirilen tüm proteinlerden elde edilen tamponların kombinasyonu
Biotin-PEG-silan (MW 3,400)	Laysan Biyo A.Ş	biotin-PEG-SIL-3400	2-5 mg alikotlara dağıtılır, nitrojenle doldurulur, parafilme alınır ve kullanıma kadar kurutucu madde ile -20 ° C'de saklanır
Biyotinile aktin	Hücre İskeleti A.Ş; Ev yapımı	AB07	Biyotin-aktin, lizin kalıntıları üzerinde etiketleme yoluyla yapılır ve bu nedenle en az %100 etiketli olduğu varsayılır, ancak farklı lotlara/preparatlara göre değişir. Optimal biyotinile aktin konsantrasyonları, belirli kullanımlar/deneysel tasarımlar için ampirik olarak belirlenmelidir. Daha yüksek konsantrasyonlar daha verimli izlemeye izin verir, ancak polimerizasyonu veya düzenleyici proteinlerle etkileşimleri engelleyebilir. Burada, son TIRF reaksiyonunda küçük bir yüzde (% 0.09 veya 900 pM) biyotinillenmiş aktin bulunur.
Bulaşık deterjanı	Şafak, Procter ve Kumar, Cincinnati, OH		Bilinmeyen nedenlerden dolayı, mavi versiyon lamelleri mevcut diğer renklerden daha verimli bir şekilde temizler.
Kuru buz
Floresan etiketli aktin	Hücre İskeleti A.Ş; Ev yapımı	AR05	Ev yapımı floresan etiketli aktin, -20 ° C'de% 50 gliserol ile desteklenmiş G tamponunda saklanır (Spudich ve diğerleri (1971) 47; Liu ve ark. (2022)48 ). Floresan etiketli aktin, G-tamponuna karşı diyalize edilir ve kullanımdan önce 278.000 × g'da 60 dakika boyunca ultrasantrifüjleme yoluyla ön arıtılır.
Floresan etiketli tübülin	Hücre İskeleti A.Ş	488 milyon TL, TLA590M, 670 milyon TL	20 μL 1× BRB80 (10 μM nihai konsantrasyon) içinde yeniden süspanse edilir ve kullanımdan önce 60 dakika boyunca ultrasantrifüjleme (278.000 × g) ile önceden temizlenir.
G-tamponu	Ev yapımı		3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Tampon	Ev yapımı		20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
buz
Buz kovası
Görüntüleme odası	AYNI İKİ, Fitchburg, WI	80666	Farklı lamel kaplamaları kullanmak için tabanı olmayan odalar sipariş edin
iXon Life 897 EMCCD kamera	Andor, Belfast, Kuzey İrlanda	8114137
LASX Premium mikroskop yazılımı	Leica Mikro Sistemler	8114137
Metilselüloz (4.000 cp)	Sigma Aldrich A.Ş	M0512
TIRF modülü ile donatılmış mikroskop tabanı	Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya	11889146
mPEG-silan (MW 2.000)