$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. LLSM Günlük Hizalamasının Yürütülmesi
>NOT: (Önemli) Bu hizalama protokolü, kullanılan LLSM cihazını temel alır (Malzeme Tablosuna bakın). Her LLSM farklı olabilir ve özellikle ev yapımı olanlar olmak üzere farklı hizalama stratejileri gerektirebilir. Uygun rutin hizalamayı gerçekleştirin ve bölüm 2'ye devam edin.
- LLSM banyosuna (~10 mL hacim) 10 mL su artı 30 μL floresein (1 mg/mL stok) ekleyin, hedefi görüntü konumuna taşımak için Görüntü (Ana Sayfa) düğmesine basın ve tek bir Bessel lazer ışını modeline bakın. Işını her yönde dengeli ince bir desen haline getirmek için kılavuzları ve önceden ayarlanmış ilgi alanını (ROI) kullanarak lazer ışınını hizalayın.
- Işın ayrıca bulucu kamerada odaklanmış görünmelidir. Ayarlamak için iki ayna eğim ayarlayıcısı, bir üst mikrometre, odak ve bir emisyon objektif bileziği kullanın. Doğru hizalanmış ışın için Şekil 1 A ve B'ye bakın.
- Floreseini tamamen çıkarmak için banyoyu ve objektifleri en az 200 mL su ile yıkayın.
- Görüntüleme ortamındaki fiziksel nokta yayılma fonksiyonu (PSF) için görüntüleme ortamındaki standart floresan boncuklar (poli-L-lizin ile 5 mm'lik bir lamel üzerine boncuklar yapıştırılarak hazırlanır, Malzeme Tablosuna bakın; bu önceden hazırlanabilir ve yeniden kullanılabilir).
NOT: Daha sonra işlenmek üzere görünümde yalnızca bir boncuk olabilir, bu nedenle görüntüleyicide kendi başına olan veya tek bir boncuk elde etmek için kolayca kırpılabilen bir boncuk bulmaya çalışın.
- 'X Galvo aralığı' kutusunda 3'e ayarlayarak renk taklidini açın. Geçerli alanı görüntülemek için Canlı'ya basın. Lameli ve boncukları bulmak için Z yönü boyunca hareket edin. Z boyunca hareket ederek bir boncuğun merkezini bulun, lazeri duraklatmak için Durdur'a basın. 3D'yi kontrol edin, Orta'ya basın ve ardından Yürüt'e basın. Bu, verileri toplayacaktır.
- En yüksek gri değerler için eğim aynasını, objektif bileziğini ve odak mikrometresini manuel olarak ayarlayın, ardından objektif taraması, z galvo, z+objektif (totPSF) ve numune taraması (samplePSF) yakalama modları için uygun desenleri elde etmek için gerektiği gibi ayarlayın. Uygun şekilde ayarlanmış maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIP'ler) için Şekil 1 CF'ye bakın.
not: Çeşitli yakalama modları (objektif taraması, z galvo, z+objektif ve numune taraması), ışık tabakasının numune içinde nasıl hareket ettiğini değiştirir. Hizalama için tüm tarama modları kullanılmalıdır.
- Örnek tarama, deney sırasında verilerin nasıl toplanacağını gösterir. Eğrilik düzeltme ve evrişim giderme için örnek tarama modunda Yürüt'e basarak örnek PSF'yi toplayın. Lazerleri üç renk moduna (488, 560, 647) değiştirin ve tekrar Çalıştır'a basın.
not: LLSM görüntüleri bir açıda (57,2°) olduğundan, "örnek tarama" modunda yakalanan görüntüler bu açıda toplanır ve bu nedenle "eğri" olur. Eğriliği giderme, bu açıyı düzeltme ve görüntüyü gerçek bir z yığınına "yeniden hizalama" işlemidir. Bu verilerin görüntüleme ortamlarında ve deney sırasında görüntülenecek tüm kanallarda toplanması gerekmektedir. Bu düzgün bir şekilde toplanmazsa, veriler düzgün bir şekilde çarpıtılmaz. Benzer şekilde, ortamın 37 °C'ye (veya istenen deneysel sıcaklığa) ısıtıldığından emin olun.
2. LLSM ile Hücreleri Ayarlama
- 100.000 antijen sunan hücre (APC) (50 μL) 5 mm çapında dairesel bir lamel ekleyin ve 10 dakika boyunca oturmalarına izin verin.
- Numune tutucuyu yağlayın ve ardından lamel hücresini yukarı bakacak şekilde ekleyin. Banyoya yerleştirmeden önce kabarcıkları önlemek için lamellerin arkasına bir damla görüntüleme ortamı ekleyin. s'yi vidalayınampleto piezo ve Görüntü (Ana Sayfa) düğmesine basın.
- LLSM ve görüntüleme yazılımının (Malzeme Tablosuna bakın) düzgün çalıştığından emin olmak için bir APC to image bulun.
not: 0,4 μm adım boyutunda 60 z adımında ve iki renk için 10 ms pozlama ile renk taklidi 3'e ayarlanmışken görüntülüyoruz, bu da ~200 nm XY ve 400 nm Z çözünürlüğe sahip 3D görüntünün kare başına 1,54 sn ile sonuçlanıyor. Bu ayarların hücre boyutuna, istenen z çözünürlüğüne ve kullanılan floresan etiketleme tekniğinden gelen sinyalin gücüne göre ayarlanması gerekebilir. Lazer gücü kullanımı, kullanılan floresan etiketleme tekniğine bağlı olarak da değişecektir.
- Geçerli görüntüyü görüntülemek için Canlı'ya basın. Lameli ve hücreleri bulmak için Z boyunca hareket edin.
- Z yönünde hareket ederek bir APC'nin merkezini bulun, ardından lazeri duraklatmak için Durdur'a basın. 3D'yi kontrol edin ve istediğiniz ayarları girin, Orta'ya basın ve ardından Yürüt'e basın. Bu, verileri toplayacaktır.
- Yükleme pozisyonuna kadar sahneyi indirin ve görüntüleme ortamına (100.000 hücre) 50 μL T hücresi ekleyin. Pipet ucunun ucunda bir damla oluşmasına izin vermek ve ardından ucu banyo sıvısına dokundurmak en iyisidir. "Görüntü (Geri Dön)" seçeneğine tıklayarak sahneyi geri kaldırın.
- Görüntülemeye başlayın. İstenen yığın boyutunu ve hızlandırılmış uzunluğu ayarladığınızdan emin olun. Örneğin, 0,4 μm'lik bir adım boyutunda 60 z-yığını görüntüleyin ve 500 zaman dilimi girin. (Tipik olarak) foto ağartmayı önlemek için 500 kareye ulaşılmadan önce kaydı durdurun. Hücre çiftlerini aramak için Canlı modu kullanın ve hazır ve istenen ayarlar girildiğinde, verileri toplamak için Yürüt'e basın. Bir örnek için Şekil 2'ye bakın.
