$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Mikroskop lamı hazırlama
NOT: SPT deneylerinde yüksek aktiviteye sahip üçüncü ila onuncu nesil U87 MG hücreleri kullanılır.
- Piranha solüsyonu ile önceden temizlenmiş 22 mm × 22 mm lameller etanole (% 99,9) batırılarak sterilize edilir.
- Etanol çözeltisinden kapak fişini çıkarmak için forseps kullanın (adım 1.1) ve alevde etanol yakarak sterilize edin. Tüm etanol yandıktan sonra, lamelleri 2 mL hücre ortamı (fenol kırmızısı yok) ile doldurulmuş plastik bir hücre kültürü kabına (35 x 10 mm) yerleştirin.
- Lamel üzerine 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için tabağı hafifçe ileri geri ve sola ve sağa itin. Nemlendirilmiş bir atmosfere yerleştirin.
- Lamel üzerindeki U87 MG hücreleri %20-40 birleşmeye (~ 12 saat) ulaştığında, 20 μL CTAB-AUNR (koruyucu madde olarak setiltrimetilamonyum amonyum bromür molekülü ile sentezlenen altın nanoçubuklar, 138 pM) tabağa ekleyin ve dağıtın. Nemlendirilmiş bir atmosferde 5 dakika inkübe edin.
- Adım 1.4'teki çanaktan 100 μL kültür ortamı (fenol kırmızısı yok) Piranha çözeltisi ile önceden temizlenmiş olan yivli cam sürgünün (Şekil 1) oluğuna ekleyin.
- Lameli tabaktan çıkarın ve mikroskop cam lamının oluğunun üstüne ters çevirin (Şekil 1). Oje ile kapatın, kurumasını bekleyin ve SPT deneyleri yapmak için sahneye yerleştirin.
>2. Karanlık alan mikroskobu ile tek parçacık izleme deneylerinin gerçekleştirilmesi (Şekil 1).
- Yağa daldırılmış karanlık alan kondansatörüne (sayısal açıklık (NA) 1.43-1.20) bir damla yağ koyun ve kondansatörün cam sürgüye temas etmesini sağlamak için düğmeyi çevirin.
- Kapak camının üstüne bir damla yağ damlatın ve 60x yağa daldırma hedefinin (NA 0.7–1.25) yağa temas etmesini sağlamak için odaklama düğmesini çevirin.
- Görüntüleme düzlemini odaklamak için ışık kaynağını açın ve odaklama düğmesini hafifçe çevirin.
not: Görüş alanında, arka plan siyahtır, hücreler parlaktır ve CTAB-AuNR'ler (en boy oranı~2:1, Şekil 2) küçük renkli (kırmızı, sarı veya yeşil) saçılma noktalarıdır.
- Renkli bir CMOS kamera ile örnek saçılma ışığını yakalayın. Görüntüleri kaydetmek üzere TIFF formatını kaydetmek ve dışa aktarmak için yazılımdaki "Kamera simgesine" tıklayın.
3. Veri toplama
- Tek bir uzun vadeli yörünge ayıklayın
- Zaman serisi karanlık alan görüntülerini "RGB renk" modundan "8 bit" moduna dönüştürmek için Şekil 3'te açıklandığı gibi çalıştırın. Resimde J tıklayın Resim | Türü | 8 bit. Kontrastı ayarlamak için Görüntü | Ayarla | Parlaklık | Karşıtlık.
- Bir hedef parçacık seçin ve "Ctrl+X" ile arka planı kutulayıp silerek zaman serisi arka planlarını kesin.
- "Eklentiler | Parçacık İzleyici Klasik | Parçacık İzleyici".
- Yarıçapı 6, Kesmeyi 0 ve Yüzdebirlik değerini %0,01 olarak ayarlayın.
not: Parçacığı algılamak için, Önizleme yardımıyla yukarıdaki üç parametreyi ayarlayın. Yarıçapın hedeflenen parçacıktan biraz daha büyük ve parçacıklar arası en küçük ayrımdan daha küçük olduğundan emin olun. Yüzdelik dilim, aday parçacıklar olacak yoğunluk dağılımının alt sınırıdır.
- Bağlantı aralığını 5 ve yer değiştirmeyi 10.
olarak ayarlayın
not: Parçacığı ardışık bitişik çerçeveler arasında bağlamak için yukarıdaki iki parametreyi ayarlayın. Yer değiştirme, bir parçacığın birbirini izleyen iki kare arasında hareket ettirebileceği maksimum pikseldir ve Bağlantı Aralığı, en iyi karşılık gelen eşleşmeyi belirlerken dikkate alınması gereken ardışık kare sayısıdır.
- Sonuçları görmek üzere ParticleTracker Sonuçları penceresini açmak için "Tamam"a tıklayın.
- Oluşturulan yörüngeleri incelemek için "Tüm Yörüngeleri Görselleştir"e tıklayın.
- Yazılım tarafından oluşturulan yörünge AuNR'nin hareketli yörüngesiyle eşleşmiyorsa, tespit edilen parçacıkları farklı bağlantı aralıkları ve yüzdelik parametrelerle yeniden bağlamak için üst kısımdaki "Parçacıkları Yeniden Bağla" menüsünü tıklayın.
- Yazılım tarafından oluşturulan yörünge ile AuNR'nin hareketli yörüngesi eşleşiyorsa sonuçları kaydetmek için "Tam Raporu Kaydet"e tıklayın.
NOT: Resim J ile tek bir uzun vadeli yörüngenin çıkarılmasına ilişkin bir örnek Şekil 4'te gösterilmiştir.
