Mikrotübül Dinamiğinin Etiketsiz Görselleştirilmesi için Girişim Yansıma Mikroskobu

Abstract

Kaynak: Mahamdeh, M., et al. Mikrotübüllerin Etiketsiz, Yüksek Hızlı Görüntülenmesi için Girişim Yansıma Mikroskobunun Uygulanması. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, uygun bir tampon varlığında bir lamel yüzeyinde büyüyen mikrotübülleri görselleştirmek için girişim yansıma mikroskobu (IRM) tekniğini açıklıyoruz. Gelen ışıkla aydınlatıldıktan sonra, lamel tampon arayüzü ve tampon-mikrotübül arayüzü ışığı yansıtır, bu da bir girişim deseni oluşturmak için birleşerek mikrotübüllerin parlak bir arka plana karşı yüksek kontrastlı görüntüler olarak görselleştirilmesini sağlar.

Protocol

1. Mikroskop modifikasyonu ve objektif lens

1. Uygun bir filtre küpü kullanarak floresan mikroskobun filtre çarkına 50/50'lik bir ayna yerleştirin (Şekil 1). 50/50 aynayı, yansıma önleyici kaplamaya sahip oldukları için dikkatli kullanın.
   not: Mikroskobun boş bir filtre küpünde 50/50'lik bir ayna kullandık. 50/50 ayna, dikroik aynanın bulunduğu yere yerleştirilir.
2. Yüksek büyütmeli/yüksek sayısal açıklıklı (NA) yağ objektifi kullanın.
   not: Bu protokolde 100x/1.3 NA objektif kullandık.

2. Mikrotübülleri yüzeye yapıştırmak için hazne h....

Results

Şekil 1. IRM'nin şematik gösterimi. (A) Işık kaynağından gelen epi-aydınlatma, 50/50 aynaya ulaşmadan önce diyafram açıklığından geçer. Diyafram diyaframı, ışın genişliğini ve dolayısıyla aydınlatma NA'sını ayarlar. 50/50 ayna, numuneyi aydınlatmak için ışığı objektife kadar kısmen yansıtır. Numuneden yansıyan ışık toplanır ve daha sonra görüntüyü oluşturmak için müdahale ettiği kamera çipine (tüp lens tarafından) yansıtılır. Görüntü.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mikroskop	Nikon	Ti-Tutulma	Ekspirasyonları gerçekleştirmek için kullanılan ters çevrilmiş bir mikroskop
50/50 ışın ayırıcı	Chroma	21000	Satın alırken, mikroskopta kullanılan küpe uyan ayırıcı boyutlarını seçtiğinizden emin olun
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 İris objektif	Nikon	MRH02902	Görüntüleme hedefi. Bu hedef, NA 1.3'e açılan bir NA ayarlama irisine sahiptir
Mucasol üniversal deterjan	Sigma-Aldrich	Z637181-2L	Lamelleri ve slaytları temizlemek için kullanılır
Plastik parafin film (ticari adı Parafilm M)	Sigma-Aldrich	P7793 Serisi	Akış kanalları oluşturmak için kullanılır
Anti-TAMRA antikoru	Canlandırıcı	A-6397	TAMRA etiketli molekülleri (örn. mikrotübüller) numune yüzeyine bağlamak için kullanılır. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (ticari adı Pluronic F-127)	Sigma-Aldrich		Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için kanal yüzeyini bloke etmek için kullanılır
40 nm altın nanopartiküller	Sigma-Aldrich	753637	Kontrol numunesi olarak kullanılır
20 nm altın nanopartiküller	Sigma-Aldrich	753610	Kontrol numunesi olarak kullanılır
Zyla 4.2 Kamera	Andor	Zyla 4.2	2048x2048 piksel (6.5μm piksel boyutu), %72 kuantum verimliliği ve 16 bit dinamik aralık
Feista izleme yazılımı			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
Stabilize mikrotübüller			Evde hazırlanmıştır (metindeki referanslara bakınız)