$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mikroskop modifikasyonu ve objektif lens
- Uygun bir filtre küpü kullanarak floresan mikroskobun filtre çarkına 50/50'lik bir ayna yerleştirin (Şekil 1). 50/50 aynayı, yansıma önleyici kaplamaya sahip oldukları için dikkatli kullanın.
not: Mikroskobun boş bir filtre küpünde 50/50'lik bir ayna kullandık. 50/50 ayna, dikroik aynanın bulunduğu yere yerleştirilir.
- Yüksek büyütmeli/yüksek sayısal açıklıklı (NA) yağ objektifi kullanın.
not: Bu protokolde 100x/1.3 NA objektif kullandık.
2. Mikrotübülleri yüzeye yapıştırmak için hazne hazırlığı
- Temiz mikroskop lamları ve 22 mm x 22 mm lameller (dik mikroskop için) veya 22 mm x 22 mm ve 18 mm x 18 mm lameller (ters mikroskoplar için). Yüzeyi gerektiği gibi değiştirin. Örneğin, lamelleri bir alkali deterjan kullanarak temizleyin (Malzeme Tablosuna bakınız), ardından aralarında ve sonrasında damıtılmış su ile 0 etanol kullanın.
- Bir tıraş bıçağı ve kenar olarak başka bir mikroskop lamı kullanarak 3 mm genişliğinde plastik parafin film şeritleri kesin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Temiz bir 22 x 22 mm kapak kızağı üzerine 3 mm aralıklarla iki plastik parafin film şeridi yerleştirin. Ardından bir kanal oluşturmak için 18 mm x 18 mm'lik bir lamel yerleştirin. Dik bir mikroskop kullanıyorsanız, şeritleri temiz bir mikroskop lamının üzerine yerleştirin ve ardından üstüne bir lamel yerleştirin.
- Parafin filminin sızdırmaz bir kanal oluşturması için lamel (veya slayt) 10-30 saniye boyunca 100 °C'de bir ısı bloğuna yerleştirin.
- Bir pipet kullanarak perfüzyon yoluyla 50 μg / mL antikor (Brinkley Buffer 1980'de (BRB80)) içinde akış. 10 dk.
inkübe edin
not: Rodamin etiketli mikrotübül tohumlarını yüzeye bağlamak için anti-rodamin antikorları kullanıyoruz. Alternatif olarak, avidin, biyotin etiketli mikrotübül tohumlarını bağlamak veya biyotinile edilmiş altın parçacıklarına bağlamak için kullanılabilir. Çözeltide tübülin yokluğunda (yani dinamik olmayan bir tahlil) mikrotübüllere basitçe bakmak için, bir anti-tübülin antikoru kullanılabilir.
- BRB80 tamponu ile beş kez yıkayın. Çözeltilerin 0,22 μm'lik bir filtre kullanılarak filtrelenmesi önerilir.
- Yüzeyi spesifik olmayan bağlanmaya karşı bloke etmek için BRB80'de %1 poloksamer 407 (bir triblok kopolimer) içinde akış. 10 dakika inkübe edin.
- BRB80 tamponu ile beş kez yıkayın.
- Numune mikroskoba yerleştirilmeye hazırdır. Numunenin kurumasını önlemek için, kanalın uçlarına iki damla BRB80 tamponu ekleyin ve gerektiğinde yenileyin.
3. Mikroskop hizalaması
- Numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin. Epi-aydınlatma ışık kaynağını açın.
- Örnek yüzeyine odaklanın. Optik yol içindeki optiklerden gelen ışığın geri yansıması nedeniyle objektif yukarı ve aşağı hareket ederken birden fazla yüzeyi gözlemleyeceksiniz. Numune yüzeyini bulmak için iyi bir yöntem, parafin film kenarına odaklanmaktır. Yüzey bulunduğunda, görüş alanını odanın merkezine ayarlayın.
- Alan diyaframını yarıya kadar kapatarak ve ayar vidalarını kullanarak görüş alanında ortalayın. Hizalandıktan sonra diyaframı yeniden açın.
not: Vida ayarının yalnızca ara sıra, belki de her 3-6 ayda bir veya sorun giderme sırasında yapılması gerekir.
- Objektifin çıkış göz bebeğini (arka odak düzlemi) görüntülemek için Bertrand merceğini kaydırın.
- Diyafram diyaframını (AD) objektifin çıkış göz bebeğinin kenarlarının ötesine kapatın.
- AD'yi çıkış göz bebeği ile ortalamak için ayar vidalarını kullanın. AD'yi açarak ve kenarlarını çıkış gözbebeğininkilerle eşleştirerek iki kez kontrol edin.
not: Bu ayarlamanın yalnızca ara sıra yapılması gerekir.
- Diyafram diyaframını objektifin NA'sının yaklaşık 2/3'üne ayarlayın.
4. Stabilize mikrotübüllerin veya 40 nm altın parçacığının görüntülenmesi
>NOT: Stabilize mikrotübüller ve altın nanopartiküller iyi kontrol numuneleri olarak işlev görür. IRM performansını değerlendirmek ve optimum diyafram açıklığının ayarlanmasına yardımcı olmak için ilk adım olarak yüzeye bağlı mikrotübüllerin veya altın nanopartiküllerin görüntülenmesi önerilir (bölüm 7).
- Kameranın pozlama süresini 10 ms'ye ayarlayın ve aydınlatmayı kamera dinamik aralığını neredeyse doygun hale getirecek şekilde ayarlayın.
- BRB80'de (veya 40 nm altın parçacıklarında) 10 μL guanilil- (alfa), metilen-difosfonat (GMPCCP) - veya taksol ile stabilize edilmiş mikrotübülleri bir pipet kullanarak taze bir numuneye perfüzyonla akıtın ve yüzeyi görüntüleyerek bağlanmayı izleyin. Görüş alanına 10-20 mikrotübül bağlandıktan sonra, numuneyi 2x BRB80.
ile yıkayın
not: İyi hizalanmış bir mikroskopla, mikrotübüller arka plan çıkarımı olmadan görünür olmalıdır.
- 10 saniye boyunca (10 ms pozlamada) 1 saniye gecikme süresine sahip bir zaman atlamalı çekim ayarlayarak 10 görüntü elde edin.
- Bir arka plan resmi edinin. Bunu yapmak için, sahne denetleyicisini veya bilgisayar yazılımını kullanarak sahneyi kanal uzunluğundaki eksen boyunca hareket ettirin ve gecikme olmadan 100 görüntü elde edin (yani, 100 fps @ 10 ms pozlamaya yakın akış).
not: Arka plan, 100 görüntünün ortanca değeridir. Medyan alınarak, aydınlatma profili ve optikler üzerindeki kir gibi diğer sabit özellikler korunurken diğer her şey filtrelenir. Numune üzerinde herhangi bir eğim olmamalıdır, çünkü bu, sahne alanı hareket ettirilirken eksenel konumda bir değişikliğe yol açacak ve sonuç olarak arka plan görüntüsünü bozacaktır. Eğimden kaçınılamıyorsa, alternatif bir yöntem, tohumları akıtmadan önce ortalama arka plan görüntüleri elde etmektir.
- Görüntüleri işlemek ve analiz etmek için 6. adıma gidin.
5. Mikrotübül dinamiğinin görüntülenmesi
- Beyin tübülini kullanan mikrotübül dinamikleri için örnek ısıtıcı sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
- BRB80'de 10 μL GMPCCP ile stabilize edilmiş mikrotübül tohumlarını bir pipet kullanarak taze bir numuneye perfüzyon yoluyla akıtın ve yüzeyi canlı olarak görüntüleyerek (yani akış sırasında) yüzeye bağlanmalarını izleyin. 10-20 tohum görüş alanına bağlandıktan sonra, numuneyi BRB80 ile 2x kanal hacmi kullanarak yıkayın (BRB80, 37 °C'ye veya en azından oda sıcaklığında önceden ısıtılmalıdır).
not: İyi hizalanmış bir mikroskopla, tohumlar arka plan çıkarımı olmadan görünür olmalıdır.
- Polimerizasyon karışımında akış (BRB80 tamponunda 7.5 μM etiketlenmemiş tübülin + 1 mM guanozin trifosfat (GTP) + 1 mM Ditiyotreitol (DTT)). Mikrotübül büyümesini ölçmek için, 15 dakika boyunca her 5 saniyede bir (saniyede 0,2 kare (fps)) bir görüntü elde etmek için edinme yazılımını kullanarak bir hızlandırılmış çekim ayarlayın.
- Kontrastı artırmak için, her zaman noktasında (bir yerine) 10 görüntü elde edin ve bunların ortalamasını alın. Mikrotübül büzülmesi için, zaman gecikmesini 0'a ve 10 ms'lik pozlama süresine ayarlayarak 100 fps'de görüntüler elde edin (kullanılan kameraya bağlı olarak daha küçük ilgi alanlarıyla daha yüksek fps mümkündür).
- Adım 4.4'teki gibi bir arka plan görüntüsü edinin.
6. Görüntü işleme ve analizi
NOT: Analiz için bu protokol Fiji kullanır, ancak okuyucu uygun bulduğu herhangi bir yazılımı kullanmakta özgürdür.
- Kaydedilen arka plan resimlerini açın.
- Medyan > Image > Stack > Z projesini kullanarak medyan görüntüyü (yani arka planı) hesaplayın.
- Mikrotübül dinamiği filmini Dosya > Aç'ı kullanarak bir yığın olarak (dinamik olmayan mikrotübüller için aynı) açın.
- İşlem > Görüntü hesaplayıcısını kullanarak arka plan görüntüsünü yığından çıkarın. "32bit (float) result" seçeneğini işaretlediğinizden emin olun.
- Dinamik mikrotübüller için, çizgi aracını kullanarak ilgilenilen mikrotübül boyunca bir çizgi çizin ve "t" tuşuna basarak ilgilenilen bölge yöneticisine ekleyin. İlgilenilen tüm mikrotübüller için tekrarlayın.
- Dinamik mikrotübüller için Multi-Kymo makrosunu çalıştırın. Makro, ROI yöneticisindeki her mikrotübül için bir video ve bir kymograf oluşturacaktır. Her mikrotübül benzersiz bir tanımlayıcı alacaktır.
- Dinamik mikrotübüller için, Kymo-Analysis makrosunu çalıştırın ve mikrotübüllerin büyüme oranlarını ve büzülme oranlarını ölçmek için adımlarını izleyin.
7. Diyafram diyafram boyutu
>NOT: IRM kullanarak mikrotübüllerin yüksek kontrastlı görüntülerini elde etmek için önemli bir faktör, aydınlatma sayısal açıklığının (INA) doğru ayarlanmasıdır. INA, AD'nin boyutu tarafından kontrol edilen objektifin çıkış göz bebeğine gelen aydınlatma huzmesinin boyutu değiştirilerek değiştirilebilir (AD, objektifin çıkış göz bebeği (arka odak düzlemi) ile eşlenik bir düzlemde bulunur, Şekil 1):
burada DAD, diyafram açıklığının çapıdır, fobjektif, objektifin odak uzaklığıdır ve Dep, objektifin çıkış göz bebeği çapıdır. Tipik olarak, AD floresan görüntüleme için tamamen açık bırakılır, bu nedenle INA, objektifin NA'sına eşittir. Bir floresan mikroskobunda, AD ölçeği çapını göstermez, bu nedenle INA hesaplanamaz. AD boyutunu bir objektif yardımıyla kalibre etmek mümkündür. Ancak, AD boyutu en yüksek kontrastı üreten boyuta sabitleneceği için bu gerekli değildir.
- Yüzeye yapışmış floresan etiketli stabilize mikrotübüllerden bir numune hazırlayın (adım 4.1-4.2).
not: Tetrametilrodamin işaretli mikrotübüller (Örn: 550 nm, Em: 580 nm) kullanıldı.
- Mikrotübülleri floresan olarak görüntülerken mikroskop odaklama düğmesini kullanarak odağa getirin (mikrotübüller etiketlenmemişse, bunları IRM veya DIC ile görüntüleyin).
- Kamera yazılımını kullanarak kamera pozlamasını 10 ms'ye ayarlayın.
not: Bu pozlama isteğe bağlıdır ve 100 ms'lik bir pozlama da işe yarayacaktır.
- AD'yi en küçük açıklığına kadar kapatın. Aydınlatmayı, kameranın dinamik aralığını neredeyse doyuracak veya mümkün olan en yüksek seviyeye ayarlayacak şekilde ayarlayın.
not: Kılavuz olarak, genellikle alma yazılımı tarafından sağlanan arama tablosunu kullanın.
- 10+ mikrotübül içeren bir görüş alanının 10 görüntüsünü (her saniye akış yaparak veya bir görüntü alarak) elde edin.
- Adım 4.4'teki gibi bir arka plan görüntüsü edinin.
- AD'nin boyutunu değiştirin ve tüm AD açılış aralığı için 7.5-7.6 adımlarını tekrarlayın (kapalıdan çıkış göz bebeği boyutuna kadar, Şekil 2). AD boyutu her değiştirildiğinde, aydınlatma yoğunluğunu adım 7.4'teki yoğunlukla eşleşecek şekilde ayarlayın.
- Elde edilen her görüş alanı için, işlem > görüntü hesaplayıcıyı kullanarak ve açılır menüden "çıkar" ı seçerek ilgili arka planı çıkarın. "32bit (float) result" seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Ardından, görüntü > yığınını kullanarak elde edilen görüntülerin ortalamasını alın > Z projesi> ortalaması.
- Mikrotübül sinyalinin ortalama yoğunluğu (mikrotübül yoğunluğu eksi arka planın yoğunluğu) olarak tanımlanan mikrotübüllerin sinyal-arka plan gürültü oranını (SBR) arka planın standart sapmasına bölünerek ölçün (Şekil 3).
- Her açıklık boyutu için mikrotübüllerin ortalama SBR'sini hesaplayarak optimum AD boyutunu (yani optimal INA) belirleyin ve AD boyutunu en yüksek SBR'yi üretene ayarlayın (Şekil 2). Karşılaştırılabilir kontrast üreten bir dizi AD boyutu olması mümkündür.
