Birleştirilmiş nükleozomları görselleştirmek ve karakterize etmek için statik atomik kuvvet mikroskobu

Abstract

Kaynak: Stormberg, T., et al. Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme Kullanarak Nükleozomların Yapısını ve Dinamiklerini Araştırma. J. Vis. Uzm.(2019)

Bu videoda, birleştirilmiş nükleozomları görselleştirmek için statik atomik kuvvet mikroskobunu gösteriyoruz. Bu yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniği, nükleozom yapısının incelenmesine izin verir.

Protocol

1. Nükleozomların Statik AFM Görüntülemesi için Mika Yüzeyinin İşlevselleştirilmesi

1. Tarif edildiği gibi deiyonize suda 50 mM 1- (3-Aminopropil) silatran APS stok çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltinin 1 mL alikotunu kullanana kadar 4 ° C'de saklayın.
   not: Alikotlar 4 ° C'de bir yıldan fazla saklanabilir.
2. 50 mM APS stoğunun 50 μL'sini 15 mL dd H₂O.
   içinde çözerek mika modifikasyonu için çalışan bir APS 1:300 çözeltisi hazırlayın not: Bu çalışma çözeltisi oda sıcaklığında birkaç gün saklanabilir.
3. Yüksek kaliteli mika tabakalarından 1 x 3 cm'lik mika şeritleri kesin (burada kullanılan mika için Malzeme Tablosuna bakın).
   1. Parçanın bir küvete çapraz olarak yerleştirildiğinde oturup oturmadığını kontrol edin. Mika katmanlarını her iki taraf da taze ayrılana ve parça ~0.1 mm kadar ince olana kadar parçalamak için keskin cımbız, tıraş bıçağı veya bant kullanın (Şekil 1A). Mika parçasını hemen APS dolgulu küvete yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin (Şekil 1B).
4. Mika parçasını dd H2O ile doldurulmuş bir küvete aktarın ve 30 saniye bekletin (Şekil 1C). APS-mika şeridinin her iki tarafını bir argon akışı altında tamamen kurulayın.
   not: Kurutma sırasında mika'nın kenarından suyun emilmesine yardımcı olmak için dokunmamış selüloz ve polyester temiz oda mendili (malzemelerde ayrıntılı olarak önerilen mendil) kullanılabilir.
5. Numune hazırlama için şimdi kuru mika şeridini kullanın. Aksi takdirde, parçayı temiz ve kuru bir küvette saklayın (Şekil 1D).
   not: Ortam nemli olduğunda 1-2 saat vakumda ek saklama önerilir. Protokol buradan duraklatılabilir.

2. Statik AFM Görüntüleme için APS-Mika Üzerinde Nükleozom Örneklerinin Hazırlanması

1. Birkaç manyetik diske çift yüzlü yapışkan bant uygulayın ve bunları yana yerleştirin.
2. APS-mika alt tabakayı istenen boyutta kesin (burada kullanılan MM AFM cihazı için 1 x 1 cm kareler). Bu parçaları temiz bir petri kabına koyun ve üzerini kapalı tutun.
3. 10 mM HEPES pH 7.5 ve 4 mM MgCl₂.
   içeren 0.22 μm filtrelenmiş bir tampon kullanarak birleştirilmiş nükleozomların üç seyreltmesini (0.5, 1.0 ve 2.0 nM'lik nihai nükleozom konsantrasyonları) hazırlayın not: Düşük nihai konsantrasyonda nükleozom kaybını sınırlamak için, seyreltmeler APS-mika üzerinde birikmeden hemen önce birer birer yapılmalıdır.
4. APS-mika parçasının ortasına seyreltilmiş nükleozom örneğinden 5-10 μL biriktirin ve iki dakika inkübe edilmesine izin verin. Tüm tampon bileşenlerini çıkarmak için numuneyi 2-3 mL dd H₂O ile nazikçe durulayın. Her ~0,5 mL dd H₂O kullanıldıktan sonra, fazla durulama suyunu çıkarmak için mika'yı hafifçe sallayın.
   not: Bu durulama adımı için tek kullanımlık bir şırınga önerilir.
5. Biriken numuneyi hafif bir temiz argon gazı akışı altında kurutun.
   not: Numune artık görüntülenmeye hazırdır veya argonla doldurulmuş bir vakum kabininde veya desikatörde saklanabilir. Tarif edildiği gibi hazırlanan ve saklanan numuneler, hazırlandıktan bir yıl sonra kalite kaybı olmadan görüntülenmiştir. Protokol buradan duraklatılabilir.

3. Nükleozomların Statik AFM Görüntülemesi

1. Uç tutucuya bir AFM ucu monte edin. Yay sabiti ~40 N/m ve rezonans frekansı 300 ile 340 kHz arasında olan bir uç kullanın (burada kullanılan konsollar için Malzeme Tablosuna bakın).
2. Numune ile temas etmemeye dikkat ederek bölüm 3'te hazırlanan numuneyi AFM aşamasına monte edin.ampyüzey
.
3. Toplam maksimuma gelene kadar lazeri konsol üzerine yerleştirin ve dikey ve yanal sapma değerlerini sıfıra yakın bir değere ayarlayın.
4. Rezonans frekansını bulmak için AFM probunu ayarlayın ve sürücü genliğini ayarlayın ve görüntü boyutunu 100 x 100 nm olarak ayarlayın. Yaklaşımı başlatmak için etkileşim kur düğmesine tıklayın.
5. Yaklaşıldığında, numunenin yüzeyi net bir şekilde görülene kadar Genlik Ayar Noktasını kademeli olarak optimize edin. Tarama boyutunu 1 x 1 μm'ye ve çözünürlüğü 512 x 512 piksele yükseltin. Görüntü alımını başlatmak için yakala düğmesine ve ardından etkileşime gir düğmesine tıklayın.
   not: Şekil 2'deki görüntüler, bu örnekleri görüntülerken beklenebilecek pürüzsüz arka planı göstermektedir.

Results

Şekil 1: Nükleozomların AFM görüntülemesi için APS işlevselleştirilmiş mika hazırlama işleminin şeması. (A) ~0.1 mm kalınlığında bir mika parçasının her iki tarafı da taze yarılmış. (B) Bölünmüş mika parçası, APS solüsyonunu içeren bir küvete derhal çapraz olarak yerleştirilir ve 30 dakika inkübe edilecek şekilde ayarlanır. (C) APS işlevselleştirme adımını takiben, APS-mika parçası, 30 saniyelik bir durulama için dd ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CENP-A/H4)2, rekombinant insan	EpiCypher, Durham, Kuzey Carolina	16-0010	50 ug için katalog numarası
H2A/H2B, rekombinant insan	EpiCypher, Durham, Kuzey Carolina	15-0311	50 ug için katalog numarası
H3 Oktamer, rekombinant insan	EpiCypher, Durham, Kuzey Carolina	16-0001	50 ug için katalog numarası
Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihazı Kiti, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Bilimsel, Waltham, MA	69574	10 cihaz için katalog numarası
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	500 mg için katalog numarası
Amicon Ultra-0.5 mL Santrifüj Filtreler	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	8 cihaz için katalog numarası
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25 ML	25 mL için katalog numarası
Trisin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	25 g için katalog numarası
SDS (Demokratik Güç)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	1 kg için katalog numarası
Amonyum Persülfat (AmmPS)	Bio-Rad, Herkül, CA	1610700	10 g için katalog numarası
% 30 Akrilamid/Bis Çözeltisi, 37.5:1	Bio-Rad, Herkül, CA	1610158	500 mL için katalog numarası
TEMED (TEMED)	Bio-Rad, Herkül, CA	1610800	5 mL için katalog numarası
SDS-PAGE için 4x Laemmli protein numune tamponu	Bio-Rad, Herkül, CA	1610747	10 mL için katalog numarası
2-BEN	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	10 mL için katalog numarası
ageRuler Boyalı Protein Merdiveni	ThermoFischer Bilimsel, Waltham, MA	26616	500 uL için katalog numarası
Biyo-Güvenli™ Coomassie Lekesi	Bio-Rad, Herkül, CA	1610786	1 L için katalog numarası
Nonwoven temiz oda mendilleri: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Kuzey Carolina	TX604
Muskovit Blok Mika	AshevilleMica, Newport Haberleri, VA	Sınıf-1
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	25 g için katalog numarası
Bant	İskoç-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probu (statik görüntüleme için)	Bruker AFM Probları, Camarillo, CA
Millex-GP Filtre, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	10 cihaz için katalog numarası
BL-AC10DS-A2 afm probu (HS-AFM için)	Olimpos, Japonya
Çok Modlu Atomik Kuvvet Mikroskobu	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Kaliforniya