Nükleozom dinamiklerini yakalamak için yüksek hızlı hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu

Özet

Kaynak: Stumme-Diers, M. P., et al., Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme Kullanarak Nükleozomların Yapısını ve Dinamiklerini Araştırma.J. Vis. Uzm.(2019)

Bu videoda, nükleozom komplekslerinin dinamiklerini incelemek için yüksek hızlı hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu, AFM, görüntüleme tekniklerini gösteriyoruz. AFM ucu nükleozomun yüzeyini tararken, nükleozom yüksekliğindeki değişiklikleri tespit eder ve zaman içinde DNA'nın açılmasını kaydeder.

Protokol

1. Mono-nükleozomların Sürekli Seyreltme Düzeneği

1. Merkezden uzak bir Widom 601 nükleozom konumlandırma dizisi içeren yaklaşık 400 bp'lik bir DNA substratı oluşturun ve saflaştırın.
   not: İstenmeyen di-nükleozom oluşumunu sınırlamak için, konumlandırma dizisini çevreleyen her bir 'kol' ~ 150 bp'yi geçmemelidir.
   1. Tasarlanan primerlerle birlikte plazmid pGEM3Z-601 kullanın ve PCR kullanarak substrat DNA'sını amplifiye edin. Burada kullanılan 122 ve 154 bp kol uzunluklarına sahip 423 bp alt tabaka için ileri (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') ve geri (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') astarlar kullanın.
   2. Reaksiyon karışımını içeren tüpleri 95 °C'ye önceden ısıtılmış bir termal döngüleyiciye ekleyin. Aşağıdaki programı 95 °C'de 5 dakikalık ilk denatürasyondan sonra 33 döngü boyunca çalıştırın: 95 °C'de 30 s denatürasyon, 49 °C'de 30 s tavlama ve 72 °C'de 35 s uzatma. 72 döngüyü takip eden 10 dakika boyunca 33 °C'de son bir uzatma ayarlayın.
   3. Piyasada bulunan bir PCR Saflaştırma Kiti kullanarak DNA'yı PCR karışımından saflaştırın. DNA'yı PCR temizleme kolonundan çıkarırken, kit tarafından sağlanan elüsyon tamponu yerine 10 mM Tris tamponu (pH 7.5) kullanın.
      not: Saflaştırma adımları arasında tamponları aktarmamaya ekstra özen gösterin. Kirlenmiş bir eluent, DNA konsantrasyonunu ölçerken aşağı yönde sorunlara neden olabilir ve/veya nükleozom montaj karışımının başlangıç tuzu konsantrasyonunu değiştirebilir.
2. 260 nm'de saflaştırılmış DNA'nın absorbansını ölçerek DNA konsantrasyonunu belirleyin.
   1. Yalnızca 10 mM Tris pH 7.5 elüsyon tamponunu kullanarak UV VIS Spektrofotometresinde bir boşluk toplayın. Saflaştırılmış DNA'nın bir ölçümünü toplayın.
3. Konsantrasyon belirlendikten sonra, saflaştırılmış DNA'nın 25 pmol'ünü 0.6 mL'lik bir mikrofüj tüpüne alın ve çözelti zar zor görünene kadar bir vakum santrifüjüne yerleştirin; bu tipik olarak 30 dakika ila 1 h.
   not: DNA substratı artık nükleozom montajı için hazırdır. Aksi takdirde, protokol burada duraklatılabilir ve DNA kullanıma kadar -20 °C'de saklanabilir.
4. 25 pmol DNA içeren mikrofüj tüpünü buzun üzerine yerleştirin ve nükleozom montaj bileşenlerini Tablo 1'de listelenen sırayla ekleyin. Tüm bileşenler eklendiğinde, karışımı buzdan çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
   not: 2 M nihai konsantrasyonu elde etmek için gereken NaCl hesaplanırken stok histon tamponunun tuz içeriğinin dikkate alınması çok önemlidir.
5. Sürekli bir hız seyreltme kullanarak karışımın 2 M tuz konsantrasyonunu 200 mM'ye düşürerek nükleozomları birleştirin.
   1. Bir şırıngayı 10 mM Tris pH 7.5 içeren 100 μL seyreltme tamponu ile doldurun ve bir şırınga pompasına yerleştirin.
   2. Şırınganın iğnesini mikrofüj tüpünün kapağındaki önceden delinmiş bir delikten geçirin ve montaj karışımı ile temas kurulduğundan emin olun (Şekil 1).
   3. Şırınga pompasını 120 dk.
      boyunca 0,75 μL/dk hızında çalıştırın not: Elde edilen 100 μL'lik çözelti, 250 nM nükleozom ve 200 mM NaCl içerir.
   4. Karışımı 10 K MWCO diyaliz düğmesine aktarın ve 10 mM Tris pH 7.5, 0.25 mM EDTA ve 2.5 mM NaCl içeren 200 mL önceden soğutulmuş (4 ° C) düşük tuz tamponuna karşı 4 ° C'de 1 saat boyunca diyalize edin.
6. Nükleozom düzeneğinin histon içeriğini değerlendirmek için, daha önce tarif edildiği gibi% 15 ayırma ve% 6 istifleme ile süreksiz bir SDS-PAGE jeli hazırlayın.
   1. 10 - 20 μL nükleozom stoğunu bir mikrofüj tüpüne alın ve 1 - 2x'lik bir çalışma konsantrasyonuna 4x Laemmli Numune Tamponu ekleyin.
   2. Bir kontrol olarak, bu hazırlığı 1-2 μg histon stoğu için ayrı bir mikrofüj tüpünde tekrarlayın. Numuneleri 95 °C'de ~ 5 dakika ısıtın.
   3. Numuneleri jel üzerinde bitişik şeritler halinde birbirine yükleyin. Eşit bant geçişini teşvik etmek için kullanılmayan şeritlere örnek arabelleği ekleyin.
   4. Boya cephesi istifleme jeli boyunca hareket edene kadar jeli 65 V'ta çalıştırın. Ayırma jeline ulaşıldığında, 150 V'a yükseltin ve boya cephesi jelden tamamen çıkana kadar çalıştırın.
   5. Elektroforez ünitesini sökün ve jeli dd H₂O ile doldurulmuş bir boyama kabına nazikçe aktarın. Jeli hafif çalkalama ile 5 dakika bekletin. Her seferinde taze dd H₂O kullanılarak bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
      not: Bu protokolde kullanılan Coomassie boyası, Coomassie boyaları için gereken tipik sabitleme adımlarını gerektirmez (bkz. Malzeme Tablosu). Başka bir Coomassie preparatı kullanılıyorsa, sabitleme adımlarını gerektiği gibi ayarlayın.
   6. Son durulamadan suyu çıkarın ve jeli kaplayacak kadar leke ekleyin. Jeli en az 1 saat < br / > hafif çalkalama ile bekletin not: Çalkalama için, boyama kabı, lekenin jel üzerinde hareketini teşvik eden ve aynı zamanda jeli sıvı ile kaplı tutan herhangi bir aparatın üzerine yerleştirilebilir.
   7. Lekeyi kaptan çıkarın ve jeli dd H₂O ile durulayın. dd H₂O'yu değiştirin ve jeli hafif çalkalama ile 30 dakika bekletin. (Jel, histon bantlarının net bir şekilde ayrılmasıyla Şekil 2'de gösterildiği gibi görünmelidir.)
7. Nükleozomları kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
   not: Bu koşullarda saklandığında, nükleozomlar birkaç ay boyunca stabil kalır. Protokol buradan duraklatılabilir.

2. Nükleozom Dinamiğinin Yüksek Hızlı Hızlandırılmış AFM Görüntülemesi

>NOT: Aşağıdaki protokol, Ando grubu (Kanazawa Üniversitesi, Kanazawa, Japonya) tarafından geliştirilen HS-AFM cihazı için sağlanmıştır.

1. Sıvı görüntüleme için APS-mika'yı hazırlayın.
   1. Cam çubuk-tarayıcı yapıştırıcısını kullanarak cam çubuğu AFM tarayıcı aşamasına takın (Malzeme Tablosuna bakın). Bunu en az 10 dakika kurumaya bırakın.
   2. Daha büyük bir mika tabakasından delerek 1,5 mm çapında ~0,1 mm kalınlığında dairesel mika parçaları yapın. Bu mika parçasını HS-AFM üzerindeki cam çubuğa tutturmak için HS-AFM mika-cam çubuk yapıştırıcısını (Malzeme Tablosuna bakın) kullanın ve en az 10 dakika boyunca el değmeden kurulayın. Bant üzerinde iyi bölünmüş bir tabaka görülene kadar basınca duyarlı bir bant kullanarak katmanları bölün.
   3. 500 μM'lik bir APS çözeltisi yapmak için 1 μL 50 mM APS stoğunu 99 μL dd H₂O içinde seyreltin. Bu çözeltiden 2,5 μL'yi taze bölünmüş mika yüzeyine bırakın ve 30 dakika boyunca işlevsel hale getirin.
      not: İşlevselleştirme sırasında yüzeyin kurumasını önlemek için, 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpünün kapağına nemli bir filtre kağıdı parçası takılabilir ve tarayıcının üzerine yerleştirilebilir. APS stoğu, dinamikleri AFM ile gözlemlenebilecek bir oranda kontrol etmek için sıvı görüntüleme için statik görüntülemeye göre 3 kat daha az seyreltilir.
   4. Birkaç ~3 μL durulama uygulayarak mika'yı 20 μL dd H₂O ile durulayın. Her durulamadan sonra mika'nın kenarına dokunmamış bir mendil koyarak suyu tamamen çıkarın. Son durulamadan sonra, yüzeye ~ 3 μL dd H₂O yerleştirin ve özel olarak bağlanmamış APS'yi çıkarmak için en az 5 dakika bekletin.
2. Probu HS-AFM tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu ucu yukarı bakacak şekilde AFM aşamasına yerleştirin. Tutucuyu ~ 100 μL dd H 2 O kullanarak durulayın, ardından 10 mM HEPES pH_7.5ve 4 mM MgCl₂ içeren 0.22 μm filtrelenmiş nükleozom görüntüleme tamponunun iki ~ 100 μL durulayın.
3. Durulamalar tamamlandıktan sonra, hazneyi ~ 100 μL nükleozom görüntüleme tamponu ile doldurun ve ucu batırın. Lazerle vurulana kadar konsol konumunu ayarlayın. APS-mika'yı, durulama başına ~ 4 μL kullanarak 20 μL filtrelenmiş nükleozom görüntüleme tamponu ile durulayın.
4. 1 μL'lik nükleozom montaj stoğunu, 1 nM'lik bir nihai nükleozom konsantrasyonu için 250 μL filtrelenmiş nükleozom görüntüleme tamponuna seyreltin. Bu seyreltmenin 2,5 μL'sini yüzeye bırakın ve 2 dakika bekletin. Yüzeyi ~ 4 μL nükleozom görüntüleme tamponu ile iki kez durulayın. Son durulamadan sonra, yüzeyi görüntüleme tamponunda kapalı bırakın.
   not: Nükleozom numunesi bırakıldıktan sonra yüzey durulanmazsa, yüzey hızla aşırı kalabalık hale gelecektir.
5. Tarayıcıyı ve numuneyi, numune aşağı bakacak şekilde uç tutucunun üzerine yerleştirin. Yaklaşmaya başlamak için, serbest salınım genliği A_0'a yakın bir ayar noktası genliği olan A_s ile otomatik yaklaşma fonksiyonunu kullanın.
   not: İdeal olarak, A_s = 0.95 A₀, ancak A_0'ın %82'sinde çalışmak da dikkatli olunursa işe yarayacaktır.
6. Yüzey iyi bir şekilde izlenene kadar ayar noktasını ayarlayın.
   not: AFM ucundan nükleozom numunesine enerji transferini en aza indirmek için, konsolun genliği küçük tutulmalı ve genlikler 1 nm kadar düşük olmalıdır.
7. Görüntü alanını 150 x 150 nm civarında, 200 x 200 nm olarak ayarlayın ve görüntü çerçevesi başına ~300 ms'lik bir veri toplama hızı elde edin.
   not: Bu görüntü boyutu tipik olarak birkaç nükleozomun dinamiklerini aynı anda yakalamak için yeterlidir. Daha az nüfuslu bir yüzey, bu parametrelerde değişiklik yapılmasını gerektirebilir. Önerilen kare hızı, diğerlerinin yanı sıra döngü, kaydırma ve sarmayı açma gibi nükleozom dinamiklerini yakalamak için yeterlidir (aşağıdaki Temsili Sonuçlar bölümüne bakın).

Tablo 1: Sürekli tuz gradyanlı nükleozom montajı için gereken reaktifler. Listelenen bileşenlerin her biri, saflaştırılmış DNA'yı içeren mikrofüj tüpüne eklenir. Bu, reaktiflerin tabloda listelenme sırasına göre yapılmalı, önce su ve NaCl eklenmeli, ardından H2A/H2B dimer ve en son histon tetrameri eklenmelidir. Önceden katlanmış histon oktamerleri kullanılacaksa, bunları yukarıdaki tetramer ile aynı oranda ekleyin. *Histon stoklarının her birindeki NaCl içeriğini not edin ve 5M NaCl'yi buna göre eklemek için ayarlayın, nihai [NaCl] 2M'ye eşit olmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: Mikro ölçekli nükleozom montajı için kullanılan şırınga pompasının şeması.Montaj karışımı, şırınga iğnesinin ucu ile temas edecek şekilde konumlandırılır. Seyreltme tamponu, şırınga pompası tarafından montaj karışımına verildiğinde, NaCl konsantrasyonu azalır ve nükleozom montajını teşvik eder. Bu rakam Stumme-Diers ve ark.'dan uyarlanmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Plazmid pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
PCR Primerleri	IDT, Coralville, IA	Özel Sipariş	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polimeraz	ThermoFischer Bilimsel, Waltham, MA	EP0701	200 birim için katalog numarası
PCR arıtma kiti	Qiagen, Hilden, Almanya	28104	50 birim için katalog numarası
Tris tabanı	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	250 g için katalog numarası
Edta	ThermoFischer Bilimsel, Waltham, MA	15576028	500 g için katalog numarası
(CENP-A/H4)2, rekombinant insan	EpiCypher, Durham, Kuzey Carolina	16-0010	50 ug için katalog numarası
H2A/H2B, rekombinant insan	EpiCypher, Durham, Kuzey Carolina	15-0311	50 ug için katalog numarası
H3 Oktamer, rekombinant insan	EpiCypher, Durham, Kuzey Carolina	16-0001	50 ug için katalog numarası
Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihazı Kiti, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Bilimsel, Waltham, MA	69574	10 cihaz için katalog numarası
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	500 mg için katalog numarası
Amicon Ultra-0.5 mL Santrifüj Filtreler	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	8 cihaz için katalog numarası
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25 ML	25 mL için katalog numarası
Trisin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	25 g için katalog numarası
SDS (Demokratik Güç)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	1 kg için katalog numarası
Amonyum Persülfat (AmmPS)	Bio-Rad, Herkül, CA	1610700	10 g için katalog numarası
% 30 Akrilamid/Bis Çözeltisi, 37.5:1	Bio-Rad, Herkül, CA	1610158	500 mL için katalog numarası
TEMED (TEMED)	Bio-Rad, Herkül, CA	1610800	5 mL için katalog numarası
SDS-PAGE için 4x Laemmli protein numune tamponu	Bio-Rad, Herkül, CA	1610747	10 mL için katalog numarası
2-BEN	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	10 mL için katalog numarası
PageRuler Boyalı Protein Merdiveni	ThermoFischer Bilimsel, Waltham, MA	26616	500 uL için katalog numarası
Biyo-Güvenli™ Coomassie Lekesi	Bio-Rad, Herkül, CA	1610786	1 L için katalog numarası
Nonwoven temiz oda mendilleri: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Kuzey Carolina	TX604
Muskovit Blok Mika	AshevilleMica, Newport Haberleri, VA	Sınıf-1
Aminopropil silatran (APS)	22'de tarif edildiği gibi sentezlenir
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	25 g için katalog numarası
Bant	İskoç-3M, St. Paul, MN
Aron Alpha Endüstriyel Krazy Tutkal	Toagosei Amerika, Batı Jefferson, OH	AA480	2 g tüp için katalog numarası
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	100 g için katalog numarası
Millex-GP Filtre, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	10 cihaz için katalog numarası
BL-AC10DS-A2 afm probu (HS-AFM için)	Olimpos, Japonya
Bileşik FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonya
Bileşik FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonya
Yüksek Hızlı Hızlandırılmış Atomik Kuvvet Mikroskobu	Toshio Ando, Nano-Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Kanazawa Üniversitesi, Kakuma-machi, Kanazawa, Japonya