$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
1. Birincil fiksasyon, fiksasyon sonrası, gömme, kesit alma ve kontrast oluşturma
- 2 mL'lik bir mikro santrifüjleme tüpünde 1.6 mL birincil fiksatif çözelti (0.1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7.3) % 2.5 glutaraldehit) hazırlayın. 5 °C'de en fazla 14 gün saklayın.
- Kas biyopsisinden veya tüm kastan, herhangi bir yönde maksimum 1 mm çapa sahip olan ve uzunlamasına lif yönünde enine kesite göre biraz daha uzun olan küçük bir örneği izole edin (oryantasyon amacıyla).
- Numuneyi soğuk birincil fiksasyon solüsyonunu içeren tüpe yerleştirin. 5 °C'de 24 saat saklayın.
- Numuneyi 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,3) dört kez (her yıkama arasında 15 dakika) yıkayın. Transfer pipetlerini kullanarak, kullanılmış tamponu numuneye dokunmadan tüpten çıkarın ve ardından yeni tamponu ekleyin.
not: Son yıkamanın ardından, numune birkaç ay boyunca 5 ° C'de 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda saklanabilir. Protokol buradan duraklatılabilir.
- 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,3) %1 osmiyum tetroksit (OsO4) ve %1,5 potasyum ferrosiyanür (K4Fe(CN)6) ile 4 °C'de 120 dakika süreyle son ek
not: %1,5 potasyum ferrosiyanür (K4Fe(CN)6) kullanımı, glikojen partiküllerinin optimal kontrastı için gereklidir.
- Oda sıcaklığında (RT) çift damıtılmış suda iki kez durulayın.
- Aşağıdaki konsantrasyonları kullanarak RT'de kademeli bir dizi alkole (etanol) daldırarak dehidrat:% 70 (10 dakika),% 70 (10 dakika)% 95 (10 dakika)% 100 (10 dakika)% 100 (10 dakika).
not: Her adımda, numune etanole batırılır ve daha sonra numunenin kurumasını önlemek için sadece kısmen çıkarılır. Son olarak, kalan etanol atılır.
- Aşağıdaki hacim oranlarını (propilen oksit / epossidik reçine) kullanarak RT'de dereceli propilen oksit ve epossidik reçine karışımları ile sızın: 1/0 (10 dakika), 1/0 (10 dakika), 3/1 (45 dakika), 1/1 (45 dakika), 1/3 (45 dakika), 0/1 (gece boyunca). Ertesi gün, numuneleri kalıplara %100 taze epossidik reçineye gömün ve 60 °C'de 48 saat polimerize edin.
- Uzunlamasına yönlendirilmiş liflerin ultra ince (60-70 nm) bölümlerini kesin ve bunları aşağıdaki gibi tek delikli bakır ızgaralarda toplayın.
- Bir numunenin bloğunu ultramikrotom tutucusuna monte edin.
- Doku seviyesine ulaşmak için yüzeydeki bloğu bir tıraş bıçağıyla kesin.
- Numunenin önüne bir elmas bıçak (ultra cut 45) monte edin ve numune yüzeyini bıçağa paralel olarak hizalayın.
- Numunenin yönünü kontrol etmek için elmas bıçakla yarı ince (1 μm) bir kesit oluşturun. Işık mikroskobu ile gözlem yapmak için yarı ince bölümü toluidin mavisi ile boyayın.
- Uygun ultra ince kesitler elde etmek için ilgi alanını azaltmak için bloğu daha da kırpın.
- Ultra ince (60-70 nm) kesitleri ikinci bir elmas bıçakla (ultra cut 45) kesin.
- Perfect Loop kullanarak tek delikli bakır ızgaralarda 1-2 bölüm toplayın.
not: Tek delikli bakır ızgaranın ortasında Formvar destek membranı ile tek bir delik vardır.
- Yukarıdaki ızgaraları 20 dakika boyunca uranil asetat çözeltisine (çift damıtılmış suda% 0.5) ve daha sonra 15 dakika boyunca kurşun sitrat çözeltisine (çift damıtılmış suda% 1) daldırarak bölümleri uranil asetat ve kurşun sitrat ile karşılaştırın. Izgaraları iki leke arasında ve sonrasında çift damıtılmış suda yıkayın.
not: Protokol buradan duraklatılabilir.
2. Görüntüleme
- Transmisyon elektron mikroskobunu (80 kV'luk bir hızlanma voltajında çalıştırılır), bilgisayarı ve görüntü kayıt yazılımını açın. Dijital yavaş taramalı 2 k x 2 k CCD kamera ve ilgili görüntüleme yazılımı ile dijital görüntüler kaydedin.
- Mikroskop aşamasına birden fazla bölümlü ızgarayı yerleştirin.
- Bölümlerin kalitesini (yani, destek zarındaki delikler, döküntüler vb.) belirlemek ve en kaliteli bölümleri seçmek için ızgarayı başlangıçta düşük büyütmede (örn. x100) tarayın. Düşük büyütmede, kas liflerinin yönünü belirleyin.
- Ardından, kesitteki çevresel bir fiber üzerinde ortalanmış ışın ile büyütmeyi artırın. Varsa, Gerçek Zamanlı Hızlı Fourier Dönüşümü tarafından yönlendirilen görüntüde yeterli ince ayrıntıyı sağlamak için görüntüyü 30 k'nin üzerindeki büyütme oranında odaklayın. Son olarak, istenen büyütmede 1 s pozlama süresine sahip görüntüleri kaydedin.
- Rastgele seçilen bir lifin toplam 24 görüntüsünü, yani 10 k ile 40 k arasında bir büyütmede miyofibriller boşluğun 12 görüntüsünü ve subsarkolimal boşluğun 12 görüntüsünü elde edin. Tarafsız sonuçlar elde etmek için görüntülerin fiberin uzunluğu ve genişliği boyunca rastgele ancak sistematik bir sırayla dağıtıldığından emin olun (Şekil 1A).
not: Optimum büyütme, mevcut kamera çözünürlüğüne ve mikrografların boyutuna bağlıdır. Amaç, glikojen partikül çaplarının 1 nm'lik adımlarla ölçülebildiği nihai bir çözünürlük elde etmek ve en az 70μm2'lik miyofibriller bölgenin toplam alanını ve en az 25 μm'lik bir lifin toplam uzunluğunu, miyofibriller boşluğun 12 görüntüsüne ve lif başına subsarkolimal boşluğun 12 görüntüsüne dağıtılmasını sağlamaktır. sırasıyla. Lif başına 24 görüntü, büyük olasılıkla, insan, sıçan ve fare iskelet kaslarından elde edilen bireysel liflerde 0,1 ile 0,2 arasındaki farklı glikojen havuzlarının hacimsel içeriğinin bir kesinliğini (hata katsayısı) verecektir (Şekil 2E).
- Toplam 6-10 lif görüntülenene kadar 2.4 ve 2.5 adımlarını tekrarlayın. Gerekirse, ek bölümler kesin (önceden görüntülenen liflerin üst üste binmesini önlemek için en az 150 μm ile ayrılmış) ve 1.9-2.5 adımlarını tekrarlayın.
3. Görüntü analizleri
- Dosya > Aç'a tıklayarak görüntüleri ImageJ'ye aktarın.
- Analiz Et > Ölçeği Ayarla'ya tıklayarak genel ölçeği görüntünün orijinal boyutuyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
- Görüntüye tıklayarak %100 yakınlaştırın > > Yakınlaştırın.
- Araçlar menüsündeki Düz Çizgi aracını kullanarak miyofibriler boşluğun görüntüsü başına bir Z-diskinin kalınlığını (lif başına 12) ölçün (Şekil 1D). 6-10 fiberin her birinin ortalama Z-disk kalınlığını hesaplayın.
- En kalın ortalama Z-diskine sahip 2-3 fiberi tip 1 fiberler olarak ve en ince ortalama Z-diskine sahip 2-3 fiberi tip 2 fiberler olarak tanımlayın. Daha fazla analiz için ara 2-4 lifi göz ardı edin (Şekil 1E).
NOT: Numunedeki 4-6 lifin her biri için aşağıdaki adımlar tekrarlanır. Glikojen hacim fraksiyonları, nokta sayımı ile tahmin edilir. Izgaraların boyutu, tahminlerin tatmin edici bir yüksek hassasiyetini elde etmek için seçilir. Bu genellikle 250 isabet elde edilerek elde edilir, bu da daha sonra ihtiyaç duyulan toplam puan sayısını ve dolayısıyla puan başına alanı belirler.
- Subsarkolimal bölgenin hemen altında görünen en dıştaki miyofibrilin uzunluğunu ölçmek için Segmentli Çizgi aracını kullanın (Şekil 2A).
not: Bu uzunluk, yüzey alanı başına subsarkolimal glikojeni ifade etmek için kullanılır (yani, en dıştaki miyofibrilin uzunluğu, bölümün kalınlığı ile çarpılır (60 nm); bkz. adım 4.5). Bu nedenle, sadece bu uzunluk ile temsil edilen subsarkolimal bölge analize dahil edilir.
- Analyze > Tools > Grid'e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alanı 32.400 nm2 olarak ayarlayın. Bir haçın subsarkolimal glikojene çarptığı 12 subsarkolimal görüntüde mevcut uzunluk içindeki isabet sayısını sayın (Şekil 2A). Bir vuruş, bir çaprazın sağ üst köşesinde bulunan bir glikojen parçacığı olarak tanımlanır.
- Analyze > Tools > Grid'e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alanı 160.000 nm2 olarak ayarlayın. Bir çarpı işaretinin intramiyofibrillar boşluğa çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın (Şekil 2B).
- Analyze > Tools > Grid'e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alanı 3.600 nm2 olarak ayarlayın. Bir çaprazın intramiyofibriller glikojene çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın (Şekil 2C).
- Analyze > Tools > Grid'e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alanı 32.400 nm2'ye ayarlayın. Bir haçın intermiyofibriller glikojene çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın (Şekil 2D).
- Düz Çizgi aracını kullanarak, lif başına havuz başına ortalama 60 parçacık elde etmek için 12 görüntünün her biri için her havuzun rastgele seçilen beş glikojen parçacığının çapını ölçün.
NOT: Ortalama 60 partikül, lif içindeki varyasyonu büyük ölçüde kapsar (Şekil 2F).
