Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Membran Fırfır Oluşumunun Miktar Tayini

Özet

Kaynak: Ahn, W. et al., Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Membran Fırfır Oluşumunu Görselleştirme.J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, taramalı elektron mikroskobu, SEM kullanarak zar fırfırları gösteren bir makrofaj hücresinin numune hazırlama, fiksasyon ve görüntülemesini göstermektedir. Membran morfolojisi ve organizasyonu hakkında ayrıntılı bilgi, hücrelerin fizyolojik durumunu anlamak için çok önemlidir.

Protokol

1. Hücre hattı ve hücre kültürü

1. 37 ° C ve% 5 CO 2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde% 10 (hacim / hacim) ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 IU / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) RAW 264.7 makrofajları büyütün. Büyüme ortamını her gün değiştirin.
2. Hücreler% 80 birleştiğinde, plakayı steril PBS kullanarak iki kez yıkayın.
3. 1.000 μL% 0.5 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri ayırın ve hücre kültürü plakasını 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 3-5 dakika inkübe edin.
4. Hücre ayrışmasını doğrulamak için plakayı ışık mikroskobu altında inceleyin. Tripsini inaktive etmek için% 10 FBS içeren 10 mL büyüme ortamı ekleyin.
5. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Tam hücre kültürü ortamındaki hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin ve Tripan Mavisi (% 0.4) boyama kullanarak hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
   not: Bu deney için önerilen minimum hücre canlılığı %>90'dır.
6. Steril cam lamelleri otoklavlanmış forseps kullanarak 24 oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin. Hücreleri 1 x 10⁶ hücre/mL yoğunlukta lamellere tohumlayın ve plakayı gece boyunca 37 °C ve %5 CO_2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
7. İşlemden önce her bir kuyucuğun ortamını taze 500 μL tam ortam ile değiştirin. Makrofajları araç (DMSO veya EIPA'yı çözmek için kullanılan diğer çözücüler) veya makropinositoz inhibitörü 5- (N-etil-N-izopropil) -Amilorid (EIPA, 25 μM) ile 30 dakika boyunca ön işlemden geçirin.
8. Membran fırfırlamasını teşvik etmek için hücreleri araç ve makropinositoz uyarıcıları ile tedavi edin: phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA, 1 μM, 30 dk) ve makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF, 100 ng / mL, 30 dk).
   not: Alternatif inhibitörler [ör., latrunculin A (1 μM, 30 dk) veya sitokalasin D (1 μM, 30 dk)] ve stimülatörler [ör., epidermal büyüme faktörü (EGF, 100 ng / mL, 10 dk) veya trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF, 100 ng / mL, 15 dk)] makrofajlarda ve diğer hücre tiplerinde makropinositozu karakterize etmek için de kullanılabilir. Hücreler, makropinositozun fizyolojik uyarıcıları ile tedaviden önce gece boyunca serum açlığına ihtiyaç duyabilir. Diğer hücre tiplerinde makropinositozu uyarmak için en etkili konsantrasyonların ve kuluçka sürelerinin belirlenmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.

2. SEM fiksasyonu

1. İşlemden sonra, ortamı kuyulardan aspire edin ve lamelleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
2. Hücreleri (0.1 M sodyum kakodilat içinde% 4 paraformaldehit ve% 2 glutaraldehit) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sabitleyin, ardından fiksatifte 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
3. Hücre tek tabakasını bozmadan, lamelleri aşağıdaki reaktiflerden 500 μL ile nazikçe yıkayın ve inkübe edin.
   1. 0.1 M sodyum kakodilatta bir kez yıkayın ve 15 dakika inkübe edin.
   2. Her yıkamada 10 dakika inkübasyon ile dH₂O ile iki kez yıkayın.
   3. Her yıkamada 10 dakika inkübasyon ile% 25 etanol ile iki kez yıkayın.
   4. Her yıkamada 10 dakika inkübasyon ile% 50 etanol ile iki kez yıkayın.
   5. Her yıkamada 10 dakika inkübasyon ile% 75 etanol ile iki kez yıkayın.
   6. Her yıkamada 10 dakika inkübasyon ile% 80 etanol ile iki kez yıkayın.
   7. Her yıkamada 10 dakika inkübasyon ile% 95 etanol ile iki kez yıkayın.
   8. % 100 etanol ile iki kez yıkayın. Her yıkamada 10 dakika inkübasyon yapın.
      not: Hücrelerin havayla kurumasını önlemek için reaktiflerin değiştirilmesi/değiştirilmesi hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Lameller 4 °C'de birkaç gün boyunca %100 etanol içinde bırakılabilir. Uzun süreli saklama için, ilave %100 etanol ekleyin ve numunenin havayla kurumasını önlemek için kuyuları parafilm ile kapatın.

3. Kritik nokta kurutma

1. Lamelleri Kritik Nokta Kurutucuya yerleştirin ve üzerlerini %100 etanol ile kaplayın. Güç düğmesine basın ve CO₂ tankını açın.
2. Sıcaklık 30 °C'ye düşene kadar Soğutma düğmesine yaklaşık 0 saniye basın. Hazne penceresinde bir baloncuk görünene kadar Doldur düğmesine basın.
3. Temizleme egzozundan gelen etanol kokusu kaybolana kadar Temizleme düğmesine basın. Sıcaklık 0 °C'ye düşene kadar Soğutma düğmesine tekrar basın.
4. CO₂ tankını kapatmak ve kapatmak için Doldur ve Boşalt düğmelerine tekrar basın. Kapatmak için Soğutma düğmesine tekrar basın ve Isı düğmesine basın.
5. Sıcaklığı 42 °C'ye ve basıncı 1.200 psi'ye ayarlayın. Basınç ve sıcaklık dengelendiğinde, basıncın yavaşça düşmesini sağlamak için Boşaltma düğmesine basın.
6. Hazne basıncı 150 psi'ye ulaştığında, Havalandırma düğmesine basın ve basınç 0 psi'ye düşene kadar bekleyin. Kritik nokta kurutucuyu kapatın ve lamelleri çıkarın.
7. Lamelleri Karbon Yapıştırıcı tırnakları kullanarak SEM alüminyum numune yuvalarına monte edin ve bir püskürtme kaplayıcıda altın/paladyum kullanarak püskürtme kaplamasına tabi tutun.
8. Güç düğmesini açın ve vakum 30 mTorr'a ulaşana kadar bekleyin. Gaz anahtarını kapatarak ve İnce gaz vanasını saat yönünün tersine çevirerek nemi ve havayı çıkarmak için hazneyi yıkayın.
9. Vakum 200 mTorr'a yükseldiğinde, gaz anahtarını kapatın ve vakum 30 mTorr'a ulaşana kadar bekleyin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
10. Zamanlayıcı düğmesine basın ve Voltaj düğmesini gösterge 10 mA okuyana kadar ayarlayın. Kaplanmış lamelleri hazneden çıkarın.
    not: Numunenin kritik nokta kurutmasını ve püskürtmeli kaplamasını gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun.

4. Görüntüleme ve niceleme

1. Numune lamel parçalarını bir taramalı elektron mikroskobunun haznesine yerleştirin. Kapıyı kapatın ve Evac düğmesine basın.
2. SEM işlem yazılımını açın. İvme voltajını 15 kv'a ve çalışma mesafesini 10 mm'ye ayarlayın.
3. Koordinatlar düğmesine basın ve hücreler gözlem ekranının ortasında görünene kadar denetleyicinin etrafında hareket edin. Büyütmeyi 3.500x olarak ayarlayın ve Fotoğraf düğmesine tıklayarak örneği görüntüleyin.
   not: Plazma zarını daha ayrıntılı göstermek için daha yüksek bir büyütme seviyesi (8.500x ila 16.000x) kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.5 Tripsin-EDTA	Gibco (Gibco)	15400-054
% 2 Gluteraldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	16320
% 4 Paraformaldehit	Santa Cruz Biyoteknoloji	281692
5-(N-etil-N-izopropil)-Amilor	Sigma Yaşam Bilimleri	A3085
Karbon Yapışkan Tabletler	Elektron Mikroskobu Bilimleri	77825-09
Dimetil Sülfoksit	Corning	25-950-CQC
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı	Cytiva Yaşam Bilimleri	SH30022.01
Falcon 24 kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı TC ile muamele edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası	doğan	353047
Fetal Sığır Serumu	İkizler Burcu Biyografisi	900-108
HERAcell 150i CO2 inkübatörü	Thermo Fisher Bilimsel	51026282
Hummer Model 6.2 Püskürtmeli Kaplayıcı	Anatech Türkiye	58565
JSM-IT500HR taramalı elektron mikroskobu
Mikroskop Kapak Camı	Thermo Fisher Bilimsel	12-545-82
Kalem Strep	Gibco (Gibco)	15140-122
Phorbol 12-miristat 13-asetat	Kırlangıç Sigma	524400
RAW 264.7 makrofaj	ATCC (Uzay Servisi)	ATCC TIB-71
Rekombinant İnsan M-CSF	Peprotech teknolojisi	300-25
Samdri-790 Kritik Nokta Kurutucu	Tousimis Araştırma Şirketi	8778B
SEM Alüminyum Numune Bağlantıları	Elektron Mikroskobu Bilimleri	75220
Sodyum Kakodilat	Elektron Mikroskobu Bilimleri	12300
Tripan Mavisi Çözeltisi	Thermo Fisher Bilimsel	15250061

Serisi arası Serisi arası