Mikrovasküler Trombüs oluşumunu incelemek için intravital floresan mikroskobu

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hayvanların Önceden Düzenlenmesi

1. Bir fareyi tartın ve ilgili ilacı (ör., kanabinoid, 5 mg / kg vücut ağırlığı (bw)) bir insülin şırıngasına yükleyin. İlacı trombüs indüksiyonundan 30 dakika önce uygulayın.
2. Farenin boynunu başparmak ve işaret parmağı arasında ve farenin kuyruğunu küçük parmakla tutarak, hayvanı gerin ve ilacı intraperitoneal olarak (ip) karnın sol alt çeyreğine enjekte edin. Hayvanı 15 dakika boyunca kafese geri koyun.
3. Ketamin (90 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (25 mg / kg canlı ağırlık) ile anestezi hazırlayın. Trombüs indüksiyonundan 15 dakika önce fareyi uyuşturun. Fareyi kafese koyun, kuyruğunu hafifçe çekin ve anestezik ipi bir insülin şırıngası ile enjekte edin.
4. Anestezi başlayana kadar fareyi tekrar kafese koyun. Yeterli anesteziyi doğrulamak için kuyruğu forseps ile sıkıştırın.
5. Bir insülin şırıngasına 0.05 mL çözülmüş floresein izotiyosiyanat etiketli dekstran (FITC-dekstran;% 5, 150 kDa) yükleyin. Şırıngayı doldururken hava kabarcığı kalmadığından emin olun, çünkü intravenöz (iv) ile uygulanan küçük hava kabarcıkları bile hayvan için öldürücü olabilir.
6. Anestezi uygulanmış fareyi yüzü aşağı bakacak şekilde bir ısıtma plakasına yerleştirin. Isıtma plakasını 37 °C'ye ayarlayın.
7. Farenin korneasına göz merhemi sürün. Cildi dezenfekte edin ve steril aletler kullanın.
8. Sağ kulağın kraniyal ve kaudal kenarına iki polipropilen 7/0 dikiş atın. Dikişleri kenara mümkün olduğunca yakın ve tabana yakın yerleştirin (Şekil 1B).
9. Fareyi sırt konumuna kaydırın. Yapışkan şeritler kullanarak tüm bacakları akrilik cam platforma sabitleyin. Ön dişlerin altına bir dikiş akalın ve dikişi yapışkan şeritlerle akrilik cama yapıştırarak başı dorsifleksiyona yerleştirin.
10. Operasyon stereomikroskobu altında hayvanı platforma yerleştirin. 16X büyütme kullanın.

2. Sol Juguler Venin Hazırlanması ve FITC-Dekstran Enjeksiyonu

Not: Sağ kulağın mikroskobu için sol şah damarını hazırlayın.

1. Bir neşter kullanarak, boynun sol tarafındaki deride kranyokaudal yönde 5 mm'lik bir kesi oluşturun. Deri altı dokusunu mikroforseps ve mikromakas ile inceleyin. Ya polyester 8/0 sütürlerle ya da elektrokoagülasyonla geçiş damarlarını bağlayın.
2. Damara dokunmadan mikro forseps ve mikromakas kullanarak damarı adventitia'dan kurtarın.
3. Floresan boyanın enjeksiyonu için hazırlanan insülin şırıngasını kullanın. Damarı delmeden damar duvarını mikroforseps ile dikkatlice tutun. Şırınga ile şişmiş damar duvarına nüfuz edin ve FITC-dekstran iv'i enjekte edin.
4. Pamuklu çubuklar kullanarak şırıngayı çektikten sonra kanamayı durdurun. Kulağın kan ve boya kontaminasyonundan kaçının.

3. İntravital Floresan Mikroskobu için Sağ Kulağın Konumlandırılması

1. Isıtma plakası üzerindeki hayvanı, ısıtma plakası için bir yuva ve kulağı konumlandırmak için 0,5 cm yüksekliğinde bir düzlem bulunan akrilik bir cam konstrüksiyona aktarın.
2. Yapışkan şeritler kullanarak hayvanı yüzü aşağı bakacak şekilde ısıtma plakasına sabitleyin. Nispeten güçlü ve dışbükey kıkırdağı kulağın tabanına, kulak için 0,5 cm yüksekliğindeki düzlemlerin yanına yerleştirin (Şekil 1B), böylece kulağın apikal kısmı düzlem üzerinde düz bir şekilde konumlandırılabilir.
3. Kulağı konumlandırmak için akrilik cam düzleme bir damla oda sıcaklığında% 0.9 NaCl ekleyin. Sağ kulağı, önceden düzenlenmiş dikişler içbükey ventral tarafında aşağı bakacak şekilde,% 0.9 NaCl damlası üzerine yerleştirin. Pamuklu çubuklar kullanarak, NaCl damlasını emdirin ve kılcal kuvvetlerin kulak düzlemini akrilik cama bağlamasına izin verin.
4. Kulağın konumunu sabitlemek için dikişleri akrilik cama bantlayın.
5. Kulağın dışbükey dorsal tarafına oda sıcaklığında% 0.9 NaCl'den bir damla ekleyin. Kulağa giren bazal damarları sıkıştırmadan kulağın üzerine dikkatlice bir lamel (0,5 cm çapında) koyun. Pamuklu çubuklar kullanarak, lamel ile kulak hedef damarları arasındaki mesafeyi en aza indirmek için lamel altından mümkün olduğunca fazla NaCl çıkarın.

>4. Sağ Kulağın İntravital Floresan Mikroskobu ve Trombüs İndüksiyonu

1. FITC-dekstran görselleştirme için intravital floresan mikroskobunu ayarlayın (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Işık kaynağı olarak değişken bir 100 W cıva lambası kullanın. Yüksek çözünürlüklü, siyah beyaz bir CCD kamerayı bir DVD kaydediciye bağlayın.
2. Hayvanı, sabit kaçırılmış kulak ile ısıtma plakasını içeren akrilik cam üzerine intravital floresan mikroskobunun masasına aktarın.
3. 20X büyütme (20X/0,95 sayısal diyafram açıklığı) ve %20 ışık yoğunluğu kullanarak, 50 - 60 μm çapında ve 400 - 600 μm/s anterograd kan akışına sahip bir venöz damar arayın.
4. 63x büyütme objektifinin (63X/0,95 sayısal diyafram açıklığı) suya daldırılması için lamele bir damla oda sıcaklığında su ekleyin. 1 mm çapında kanüllü bir şırınga kullanın ve damlayı mikroskobun objektifine yerleştirin. Lameli ve hedefi su damlası ile temas ettirecek kadar su ekleyin.
5. Su damlasının uygulanmasından hemen sonra, çapın ve kan akışının çevrimdışı ölçümü için damarı %20 ışık yoğunluğu ile 20 saniye boyunca kaydetmeye başlayın.
6. FITC-dekstran enjeksiyonundan 5 dakika sonra trombüs indüksiyonunu başlatın. Bunun için ışık yoğunluğunu %100'e yükseltin.
7. Trombüs indüksiyonu sırasında, kan akışını kontrol etmek için mikroskobun açıklığını 30 saniyelik bir süre içinde 2 saniye kapatın. Kan akışının devam etmesi durumunda, açıklığı tekrar açın. Kan akışının durması durumunda, damarı 30 s.
   not: Akıntı 30 sn veya daha uzun süre hareketsiz kalırsa veya kan geriye doğru akarsa damar tıkalı olarak sınıflandırılır. Ortograd kan akımı tekrar başlarsa, açıklığı tamamen açın ve yukarıda tarif edildiği gibi damar tıkanıklığı gerçekleşene kadar trombüs indüksiyonuna devam edin. Erken trombüs indüksiyonu sırasında, neredeyse sürekli epi-aydınlatmayı sürdürmek için kan akışını kontrol etmek için açıklığın kapatıldığı zamanların mümkün olduğunca kısa olduğundan emin olun. Daha sonra, trombüs büyümesi sırasında, damar daha az floresan bir boya ile perfüze edilir, böylece sürekli olarak gözlemlenebilir.
8. Kulak başına 5 damar seçin ve kapatın. Mikroskop altında trombüs indüksiyon süresini FITC-dekstran enjeksiyonundan yaklaşık 1 saat sonra sınırlayın.

Şekil 1. Juguler venin (A) hazırlanması ve intravital mikroskopi (B) için kulağın yerleştirilmesi. (A) Operasyon stereomikroskobu kullanılarak sağ juguler ven hazırlanır. Sol kulağın yerleştirilmesi için dikişler FITC-dekstran enjeksiyonundan önce dikilir. Sol juguler venin önceki diseksiyonundan kaynaklanan yara transkutanöz dikişlerle (B) kapatılır. Sol kulak polipropilen 7/0 dikişlerle sabitlenir. Kulağın bazal damarlarını sıkıştırmadan dikkatlice bir lamel yerleştirilir. Bir ısıtma plakası, tüm deney boyunca hayvanın vücut ısısını korur.