$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Sitospinlerin hazırlanması
- Hasta örneklerinin mononükleer hücreleri ile iki sitospin hazırlayın (ör., γH2AX immünofloresan boyama için bir sitospin ve γH2AX ve 53BP1 kombine immünofloresan boyama için bir sitospin) santrifüjleme ile (300 x g, 10 dakika) 1.0 x 10 her preparat için5 hücre (Şekil 1 ve 2).
2. γH2AX ve 53BP1 İmmünofloresan Boyama
- Fiksasyon ve geçirgenlik: Hücreleri 10 dakika boyunca 200 μL% 4 PFA ile sabitleyin. Fiksasyondan sonra, hücreleri bir laboratuvar çalkalayıcısında her biri 5 dakika boyunca 30 mL PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra hücreleri 200 μL% 0.1 Okoksinol 9 ile 10 dakika boyunca geçirgenleştirin. Hücreleri, her biri 5 dakika boyunca 30 mL% 5 bloke edici solüsyon ile bir laboratuvar çalkalayıcıda üç kez nazikçe yıkayın. Hücreleri 1 saat boyunca 30 mL taze% 5 blokaj çözeltisinde bloke edin.
- Antikorlarla inkübasyon
- Hücrelerin bir preparatını bir fare monoklonal anti-γH2AX antikoru (1:500) ile ve hücrelerin diğer preparatını bir fare monoklonal anti-γH2AX antikoru (1:500) ve bir poliklonal tavşan anti-53BP1 antikoru (1:500) ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, hücreleri bir laboratuvar çalkalayıcıda her 5 dakika boyunca 30 mL% 2 bloke edici solüsyon ile 3 kez nazikçe yıkayın.
- Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve hücrelerin ilk preparasyonunu bir Alexa488 konjuge keçi anti-fare ikincil antikoru (1:500) ile ve hücrelerin ikinci preparatını bir Alexa488-konjuge keçi anti-fare ikincil antikoru (1:500) ve bir Alexa555 konjuge eşek anti-tavşan ikincil antikoru (1:500) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Montaj ortamı: Slaytı hücrelerle birlikte bir kaseye koyun ve hücreleri bir laboratuvar çalkalayıcıda her 5 dakika boyunca 30 mL PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri 4,6-diamidino-2-fenilindol içeren bir montaj ortamı ile monte edin. Hava kabarcığı oluşmaması için montaj ortamının üzerine dikkatli bir şekilde bir lamel koyun. Hücreleri floresan mikroskobu ile analiz etmeden önce montaj ortamının sertleşmesi için en az 3 saat bekleyin.
3. γH2AX ve 53BP1 Odaklarının Analizi
- Floresan mikroskobu: 2X objektif büyütmede görüntüleme sırasında DAPI, Alexa 488 ve Cy3 için filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobu ile hücre çekirdeğindeki γH1AX ve 1BP100 odaklarını analiz edin. Görüntüleri bir kamera ile kaydedin ve görüntüleri uygun görüntüleme yazılımı ile işleyin.
