$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. 15N, 13C-Tau üretimi (Şekil 1)
- ATransform pET15b-Tau rekombinant T7 ekspresyon plazmitini BL21(DE3) yetkin Escherichia coli bakteri hücrelerine dönüştürür.
NOT: En uzun (441 amino asit kalıntısı) Tau izoformunu kodlayan cDNA, pET15b plazmidindeki NcoI ve XhoI kısıtlama bölgeleri arasında klonlanır.
- 1.5 ml'lik plastik bir tüpte 100 ng plazmit DNA ile μg plazmit DNA başına 1-5 x10 7 koloni oluşturan 50 μl yetkin BL21 (DE3) hücresini nazikçe karıştırın.
not: Ökaryotik cDNA ekspresyonu için kodon kullanımı optimize edilmiş bakteri suşları, insan Tau'su üretmek için gerekli değildir.
- Hücre karışımını 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve ardından 42 ° C'de 10 saniye boyunca ısı şoku uygulayın. Tüpü 5 dakika boyunca tekrar buzun üzerine yerleştirin ve 1 ml oda sıcaklığında LB (Luria-Bertani) ortamı ekleyin. Bakteriyel süspansiyonu 37 ° C'de hafif çalkalama altında 30 dakika inkübe edin.
- 100 μg / ml ampisilin antibiyotik içeren LB ortamının bir agar plakasına 100 μl hücre süspansiyonu içeren bir aşılama döngüsü kullanarak eşit şekilde yayın.
- Seçim plakasını 37 °C'de 15 saat inkübe edin.
- Seçim plakasını kültür adımına geçene kadar en fazla 2 hafta boyunca 4 °C'de tutun, yaklaşık olarak
NOT: Kültüre daha sonraki bir aşamada başlamak için -80 °C'de depolanan bir bakteri kültürü gliserol stoğu (%50 gliserol) hazırlanabilir.
- 1 ml otoklavlanmış M9 tuzlarına (6 g Na2HPO 4, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl) 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM vitamin takviyesi, 1 ml 100 mg / ml ampisilin ekleyin.
not: CaCl2 çözeltisinin M9 tuzlarına eklenmesiyle beyaz bir çökelti oluşacak ve bu hızla dağılacaktır.
- 300 mg 15N, 13C-tam ortam, 1 g 15NH4Cl ve 2 g 13C6-glikozu 10 ml M9 ortamında çözündürün. İzotop çözeltisini 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak doğrudan M9 ortamına filtreyle sterilize edin.
- Bir aşılama döngüsü kullanarak, 100 μg/ml ampisilin ile desteklenmiş 20 ml LB besiyerinde seçim plakasından bir pET15b-Tau dönüştürülmüş bakteri kolonisini askıya alın.
- Aşılanmış ortamı 37 ° C'de yaklaşık 6 saat inkübe edin.
- 600 nm'de (OD600) optik yoğunluğu, plastik bir spektrometre küvetinde 1 ml on kat bakteri kültürü seyreltmesinde ölçün.
not: 3.0-4.0 OD600'e karşılık gelen bakteri kültürünün bulanıklığı, doygunluk büyüme aşamasına ulaşıldığını gösterir.
- 20 L Erlenmeyer plastik şaşkın kültür şişesinde ampisilin (100 μg / ml nihai konsantrasyon) ile takviye edilmiş 1 L M9 büyüme ortamına 2 ml doymuş LB kültürü ekleyin.
- Kültür şişesini 10 °C ve 50 rpm'ye ayarlanmış programlanabilir bir inkübatöre yerleştirin. İnkübatörü ertesi gün sabahın erken saatlerinde 200 RPM ve 37 °C'ye geçecek şekilde programlayın.
- Plastik bir spektrometre küvetinde 1 ml bakteri kültürü üzerinde OD600'ü ölçün. Rekombinant Tau proteininin ekspresyonunu indüklemek için OD600 yaklaşık 1.0 değerine ulaştığında 400 μl 1 M IPTG (izopropil β-D-1-tiyokalaktopiranosid) stok çözeltisi (-20 ° C'de tutulur) ekleyin.
- İnkübasyona 37 ° C'de 3 saat daha devam edin. Bakteri hücrelerini 20 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
- Bakteri peletini -20 °C'de dondurun. Gerekirse uzun bir süre saflaştırma adımına kadar donmuş halde tutun.
2. 15N, 13C-Tau'nun saflaştırılması (Şekil 2)
- Otoklav katyon değişimi (CEX) saflaştırma tamponları 121 °C'de 15 psi'nin altında 20 dakika boyunca Tamponları 4 °C'de saklayın.
- Bakteri hücresi peletini çözün ve proteaz inhibitör kokteyli 1x (1 tablet) ve DNAseI (2.000 birim) ile taze takviye edilmiş 45 ml ekstraksiyon CEX A tamponunda (50 mM NaPi tamponu pH 6.5, 1 mM EDTA) iyice yeniden süspanse edin.
- 20.000 psi'de yüksek basınçlı bir homojenizatör kullanarak bakteri hücrelerini parçalayın. 3-4 geçiş gereklidir. Çözünmeyen materyali çıkarmak için 20.000 x g'da 40 dakika santrifüjleyin.
- Bakteri hücresi ekstraktını bir su banyosu kullanarak 75 °C'de 15 dakika ısıtın.
NOT: birkaç dakika sonra beyaz bir çökelti gözlenir.
- 20 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin ve ısıya dayanıklı Tau proteini içeren süpernatanı tutun.
- Gerekirse bir sonraki saflaştırma adımına kadar -20 °C'de saklayın.
- Hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi kullanarak 5 ml'lik bir yatak sütunu olarak paketlenmiş güçlü bir CEX reçinesi üzerinde katyon değişim kromatografisi gerçekleştirin (Şekil 3, A).
- Akış hızını 2,5 ml/dk olarak ayarlayın.
- CEX A arabelleğindeki sütunu dengeleyin
- Tau içeren 60-70 ml ısıtılmış ekstraktı bir numune pompası veya sisteme bağlı olarak alternatif olarak A pompası kullanarak yükleyin. Tau proteininin reçineye verimli bir şekilde bağlandığını doğrulamak için analiz için akışı toplayın (bkz. 2.8).
- 280 nm'deki emilim başlangıç değerine geri dönene kadar reçineyi CEX A tamponu ile yıkayın.
- CEX B tamponunun (1 M NaCl'li CEX A tamponu) kademeli olarak arttırılmasıyla elde edilen üç aşamalı bir NaCl gradyanı kullanarak kolondan Tau'yu elute edin. FPLC'yi şu şekilde programlayın: 250 mM NaCl'ye ulaşmak için 10 sütun hacminde (CV) %25 CEX B tamponuna gradyanın ilk adımı, 500 mM NaCl'ye ulaşmak için 5 CV'de %50 CEX B tamponuna ikinci adım ve üçüncü adım 1 M NaCl'ye ulaşmak için 2 CV'de %100 CEX B tamponuna. Elüsyon adımları sırasında 1.5 ml fraksiyonları toplayın.
- Elüsyon adımı sırasında toplanan fraksiyonların 10 μl'sini SDS-PAGE (% 12 SDS-akrilamid jel) ve Coomassie boyaması ile analiz edin (Şekil 3 A). 10 μl'lik akışı analiz ederek kolondaki yükleme adımını da kontrol edin.
- Tau içeren kesirleri seçin ve bir sonraki adım için bu kesirleri bir araya getirin.
- Tau içeren havuzlanmış kesirler üzerinde bir tampon değişimi gerçekleştirin (Şekil 3 B).
- Bir FPLC sistemi kullanarak 53 ml G25 reçine paketli yataktan (26 x 10 cm) oluşan bir tuzdan arındırma kolonunu 50 mM amonyum bikarbonat (uçucu tampon) içinde dengeleyin.
- Akış hızını 5 ml/dk'ya ayarlayın. Tau örneğini 5 ml'lik bir enjeksiyon döngüsü ile kolona enjekte edin. 280 nm'de absorpsiyon zirvesine karşılık gelen fraksiyonları toplayın.
- İlk CEX havuzunun hacmine bağlı olarak enjeksiyonu 3-4 kez tekrarlayın.
- 280 nm'de kromatogramın tepe alanını kullanarak saflaştırılmış Tau proteini miktarını hesaplayın (1 mg Tau, 140 mAU*ml'ye karşılık gelir).
not: Tau proteininin 280 nm'de yok olma katsayısı 7,550 M-1 cm-1'dir. Tau herhangi bir Trp kalıntısı içermez.
- Tüm Tau kesirlerini bir araya getirin.
- Numuneyi 1 ila 5 mg Tau eşdeğeri içeren tüplere ayırın. Bu tüpleri, çözelti hacmi tüpün hacmine kıyasla küçük olacak şekilde seçin (örneğin, 50 ml'lik bir tüpte 5 ml çözelti).
- Bir iğne kullanarak tüp kapaklarına delikler açın. Tau örneklerini -80 °C'de dondurun.
- Tau örneklerini liyofilize edin. Liyofilize Tau proteini -20 °C'de uzun süre saklanabilir.
3. 15N-Tau'nun in vitro fosforilasyonu
- 5 mg liyofilize Tau'yu 500 μl fosforilasyon tamponunda (50 mM Hepes·KOH, pH 8.0, 12.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl) çözün.
- 2.5 mM ATP (-20 °C'de tutulan 25 μl 100 mM stok çözeltisi), 1 mM DTT (-20 °C'de tutulan 1 μl 1 M stok çözeltisi), 1 mM EGTA (2 μl 0.5 M stok çözeltisi), 1x proteaz inhibitör kokteyli (1 tabletin 1 ml fosforilasyon tamponunda çözülmesiyle elde edilen 25 μl 40x stok) ve 1 μM aktive edilmiş His-ERK2 (250 μl) ekleyin koruma tamponunda 10 mM Hepes, pH 7.3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl ve %10 gliserol, -80 °C'de saklanır) toplam 1 ml.
not: Aktive edilmiş His-ERK2, MEK kinaz ile fosforilasyon yoluyla kurum içinde hazırlanabilir.
- 37 °C'de 3 saat inkübe edin.
- ERK kinazı inaktive etmek için numuneyi 75 °C'de 15 dakika ısıtın.
- 15 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve saklayın.
- 1 ml'lik bir numune için uygun olan 3,45 ml G25 reçine paketli yataktan (1,3 x 2,6 cm) oluşan bir sütun kullanarak protein örneğini 50 mM amonyum bikarbonat içine tuzdan arındırın.
- Hem bütünlüğünü hem de verimli fosforilasyonunu kontrol etmek için 2,5 μl protein numunesi ile %12'lik bir SDS-PAGE çalıştırın (Şekil 4).
- Fosforile Tau örneğini liyofilize edin. Tozu -20 °C'de saklayın.
>4. NMR Spektrumlarının Edinilmesi (Şekil 5)
- 4 mg liyofilize 15N, 13C ERK-fosforile Tau'yu 400 μl NMR tamponunda (50 mM NaPi veya 50 mM döteryumlu Tris-d11) çözündürün. Cl, pH 6.5, 30 mM NaCl, 2.5 mM EDTA ve 1 mM DTT).
- NMR spektrometresinin alan kilitlemesi için %5 D2Ove dahili NMR sinyal referansı olarak 1 mM TMSP (3- (trimetilsilil) propiyonik-2,2,3,3-d4 asit sodyum tuzu)) ekleyin. Tam bir proteaz inhibitörü kokteylinin 40x stok çözeltisinden 10 μl ekleyin.
- Numuneyi, uzun iğneli elektronik bir şırınga veya Pasteur pipeti kullanarak 5 mm'lik bir NMR tüpüne aktarın. Pistonu kullanarak NMR tüpünü kapatın. Piston hareketleriyle piston ile sıvı arasında sıkışan hava kabarcıklarını çıkarın.
- NMR tüpünü bir döndürücüye yerleştirin. Numune çözeltisinin çoğu NMR bobininin içinde olacak şekilde, kullanılan NMR prob kafası için uygun ölçü ile döndürücüdeki dikey konumunu ayarlayın.
- Hava akışını başlatın: mıknatıs kontrol sistemi penceresinde kaldırmaya tıklayın. Döndürücüyü, tüp ile birlikte mıknatıs deliğinin üst kısmındaki hava akışına dikkatlice yerleştirin. Hava akışını durdurun (klik kaldırma) ve tüpün mıknatıstaki prob kafasının içindeki yerine inmesine izin verin.
- Sıcaklığı 25 °C'ye (298 K) ayarlayın.
- Güç aktarımını optimize etmek için prob kafasının yarı otomatik ayarını ve eşleştirmesini gerçekleştirin. Komut satırına atmm yazın.
- Döteryum kanalında kaydedilen numunenin D2Osinyalini kullanarak spektrometre frekansını kilitleyin. Mıknatıs kontrol sistemi penceresinde kilitle'ye tıklayın.
- Numunenin konumundaki manyetik alanın homojenliğini optimize etmek için şimleme prosedürünü başlatın. Dolgu penceresini açmak için komut satırına topshim gui yazın. Dolgu penceresinde Başlat'a tıklayın. Şimlerin optimal olduğunu doğrulamak için kalan B0 standart varyasyon değerini kontrol edin (2 Hz'den azı iyidir).
- Proton dönüşlerinin 90°'lik bir dönüşünü elde etmek için gerekli olan p1 parametresini (μsaniye cinsinden bir proton radyofrekans darbesinin uzunluğu) kalibre edin. 360 boyutlu bir su protonu spektrumu kullanarak 1° darbeyi hedefleyin (Şekil 6).
- o1 parametresini (Hz cinsinden) 1D spektrumundaki proton su frekansına ayarlayarak frekans ofsetini ayarlayın (Şekil 6).
- Numuneden gelen sinyalleri doğrulamak için bir 1D proton spektrumunun (su sinyali bastırma için watergate dizisi ile darbe dizisi, örneğin, zggpw5) edinmeye başlayın (Şekil 7). Tarama sayısını bağıl protein konsantrasyonuna göre ayarlayın. Alımı başlatmak için komut satırına zg yazın.
