1. Reaksiyon bileşenlerinin çalışma konsantrasyonu
- CD için tamponların çalışma konsantrasyonlarını taze olarak hazırlayın ve reaksiyonları ayarlamadan önce 4 °C'de tutun.
not: Bu yazıda açıklanan CD reaksiyonları için, bileşenlerin çalışma konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: Sodyum fosfat tamponu (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. CD küvetlerinin seçimi ve hazırlanması
- CD spektrumlarını yüksek şeffaflıkta kuvars küvetlerde toplayın. Dikdörtgen veya silindirik küvetler kullanın.
not: Bu yazıda açıklanan tüm reaksiyonlar için bir CD kuvars küveti (nominal hacim 0.4 mL, yol uzunluğu 1 mm) kullanıldı.
- Küveti temizlemek için bir küvet temizleme solüsyonu kullanın. 400 μL çözelti yapmak için suya% 1 küvet temizleme solüsyonu ekleyin, küvete dökün ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Küveti temizlemek için küveti birkaç kez suyla yıkayın. Temiz olup olmadığını kontrol etmek için küvetteki suyu veya tamponu tarayın.
not: Su veya tampon, 0 ila 1 mdeg aralığında bir okuma vermelidir.
3. Proteinlerin ve DNA oligonükleotidinin hazırlanması
- Bazen belirsiz tepelerin oluşumuna neden olan tampon bileşenlerinin miktarlarını en aza indirmek için reaksiyonda proteinin hacmini 50 μL'nin altında tutun. Herhangi bir bozulmayı önlemek için proteini deney boyunca buzun üzerinde tutun.
- Reaksiyonlarda PAGE ile saflaştırılmış DNA oligonükleotidlerini kullanın.
not: Burada açıklanan reaksiyonlarda, DNA hem doğal hem de ısıyla soğutulmuş formlarda (hızlı soğutulmuş (FC) ve yavaş soğutulmuş (SC)) kullanılmıştır. Hızlı soğutma, DNA'da molekül içi bağlanmayı teşvik ederek daha fazla ikincil yapı sağlar. Buna karşılık, yavaş soğutma, DNA'da moleküller arası bağı teşvik ederek daha az ikincil yapı ile sonuçlanır.
- Hızlı soğutma için, DNA'yı ısıtma bloğunda 3 dakika boyunca 94 °C'de ısıtın ve hemen buz üzerinde soğutun. Yavaş soğutma için, DNA'yı 94 °C'de 3 dakika ısıtın ve dakikada 1 °C oranında oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
4. Temel spektrumları kaydetmek için kontrol deneylerinin ayarlanması
- Tüm reaksiyonlarda reaksiyon hacmini 300 μL'de tutun. 1,5 mL'lik santrifüj tüplerinde aşağıdaki gibi tek tek toplam 5 temel reaksiyon ayarlayın: i) Tampon + Su; ii) Tampon + MgCl2 + ATP + Su; iii) Tampon + MgCl2 + ATP + Protein + Su; iv) iii + EDTA veya ADAADiN; v) Tampon + Protein + Su.
5. CD spektrumlarını kaydetmek için deneyleri ayarlama
- 1.5 mL'lik santrifüj tüplerinde tek tek toplam 5 reaksiyonu aşağıdaki gibi ayarlayın: i) Tampon + DNA + Su; ii) Tampon + DNA + MgCl2 + ATP + Su; iii) Tampon + DNA + MgCl2 + ATP + Protein + Su; iv) iii + EDTA veya ADAADiN; v) Tampon + DNA + Protein + Su.
6. Taramayı kaydetme
- Gazı açın ve CD spektrometresini açın.
- 10-15 dakika sonra lambayı açın. Su banyosunu açın ve tutucu sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
- CD spektrum yazılımını açın.
- Sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
- Dalga boyu aralığını 180 - 300 nm olarak ayarlayın.
- Nokta başına süreyi 0,5 sn olarak ayarlayın.
- Tarama numarasını 5 olarak ayarlayın.
- Pro-Data Viewer'a tıklayın, yeni bir dosya oluşturun ve deney ve tarihle ilgili ayrıntılarla yeniden adlandırın.
- Herhangi bir bozulmayı önlemek için tüm reaksiyon bileşenlerini buz üzerinde tutun. Taban çizgilerini ve reaksiyonları santrifüj tüplerinde tek tek yapın ve pipetleyerek karıştırın. Reaksiyon karışımını küvete dikkatlice aktarın ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- Bir zaman rotası deneyi yapıyorsanız, reaksiyonları gereken süre boyunca 37 °C'de inkübe edin ve taramayı yapın. ATP hidrolizini durdurmak için DNA, ATP, Mg+2 ve protein içeren tampona EDTA ekleyin.
- ATPaz aktivitesini tamamen inhibe etmek için EDTA konsantrasyonunu ve inkübasyon süresini arttırın.
- Taban çizgilerini yazılımdaki karşılık gelen reaksiyonlardan çıkarın (örneğin, reaksiyon 1'i taban çizgisi 1'den çıkarın). Verileri CD spektrum yazılımında veya veri çizim yazılımında düzgünleştirin. Verileri veri çizim yazılımında çizin.
not: Taban çizgilerinin karşılık gelen reaksiyonlardan çıkarılması, yalnızca DNA'nın net CD spektrumlarını verecektir.
7. Veri analizi ve yorumlama
- Miliderece cinsinden elde edilen değerleri ortalama kalıntı eliptikliğine dönüştürmek için eq (1) tarafından verilen formülü kullanın.
Burada S, miliderece cinsinden CD sinyalidir, c, mg/mL cinsinden DNA konsantrasyonudur, mRw ortalama kalıntı kütlesidir ve l, cm cinsinden yol uzunluğudur.
- Veri çizim yazılımını kullanarak dalga boyuna ve ortalama kalıntı eliptikliğine karşı bir grafik çizin ve tepe noktalarını analiz edin.
- Grafiği çizmek için, Y ekseninde ortalama kalıntı eliptikliğini ve X ekseninde dalga boyunu seçin ve düz bir çizgi grafiği çizin.
not: Bu grafik, farklı DNA formlarının karakteristik zirvelerini sağlayacaktır. Zirvelere karşılık gelen DNA formları, mevcut literatür kullanılarak tanımlanabilir.