Spesifik Bir Antijeni Tespit Etmek için Raman Spektroskopisi Tabanlı Doğrudan İmmünoassay

Özet

Kaynak: Hanson, C., et al. UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmünoassay Platformunun Üretilmesi. J. Vis. Uzm.(2016).

Bu videoda, spesifik hedef antijenleri tespit etmek için Raman spektroskopisi tabanlı doğrudan immünoassay yöntemini açıklıyoruz. Raman problarına bağlı altın nanopartiküllerin yüzeyine adsorbe edilen antikorlar, hedef antijenlerle etkileşime girer ve daha sonra tespit edilen spesifik bir Raman spektrumu üretir.

Protokol

1. UV-Vis/Raman Problarını Hazırlayın

1. Çıplak AuNP çözümü hazırlayın
   1. ml başına yaklaşık 1 x 1011 partikül konsantrasyonuna sahip 2 ml'lik bir AuNP çözeltisi hazırlayın.
      1. AuNP'lerin konsantre edilmesi gerekiyorsa, düşük bağlayıcı santrifüj tüplerini 2.000 μl stok AuNP ile doldurun ve 20 dakika boyunca veya süpernatan berraklaşana kadar 5.000 x g'da santrifüjleyin. AuNP peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı pipetleyerek çıkarın.
      2. Kalan AuNP çözeltilerini tek bir tüpte birleştirin ve bir UV-Vis ölçümü elde ederek ve değerleri bilinen konsantrasyonlarla karşılaştırarak konsantrasyonu tahmin edin, çünkü bu doğrusal bir ilişkidir.
2. Uygun Raman raportör etiketleme oranını belirleyin
   1. Metanol içinde çözülmüş Raman raportörünün çalışan bir çözeltisini hazırlayın. Bu konsantrasyon, kullanılan muhabire bağlı olacaktır. Bu çalışmada, 200 μM'lik bir çalışma çözeltisinde 3,3'-dietiltiyatrikarbosiyanin iyodür (DTTC) hazırlayın.
   2. Her kuyucuk için 100 μl'lik bir nihai hacim varsayıldığında, 96 oyuklu bir plakanın ilk sırasının her bir oyuğuna, Raman raporlayıcısının konsantrasyonları 0,2 μM ila 10 μM arasında değişecek şekilde yeterli miktarda çalışan raportör çözeltisi ekleyin. Her kuyucuğa, hacmi 80 μl olacak şekilde yeterli HPLC dereceli su ekleyin. Her kuyucuğa 20 μl AuNP ekleyin ve son hacmi elde edin her kuyucuk için 100 μl. Tablo 1'de bir örnek verilmiştir.
   3. Plaka okumalı bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak UV-Vis spektrumlarını 400 ila 700 nm arasında ölçün. Uygun konsantrasyon, UV-Vis spektrumları için tanımlanmış tepe noktalarına sahip en yüksek konsantrasyondur. Raman raportörlerinin AuNP'lere en yüksek konsantrasyon oranı bulunana kadar artan konsantrasyonlarda adım 2.2.2'yi tekrarlayın.
      not: Boya ve AuNP şekli, boyutu ve üreticisi uygun konsantrasyonu etkiler. Bu nedenle, listelenen adımlar, kullanılan bileşenlere bağlı olarak değerlendirilmeli ve değiştirilmelidir. Bu protokol, pozitif yüklü bir boyanın kullanılmasını içeriyordu. Bu nedenle, AuNP ile raportör arasındaki bağlanma, negatif yüklü AuNP'ler kullanılarak iyileştirildi. Bu, sitrat kapaklı AuNP'ler kullanılarak yapıldı. Daha fazla ayrıntı için Tartışma bölümüne bakın.
3. Raman muhabirini ve PEG-Ab'yi AuNP'ye bağlama
   1. Daha önce belirlenen konsantrasyonda iki adet 1,5 ml'lik AuNP ve Raman raportörü hazırlayın ve Raman raportörünün oda sıcaklığında 30 dakika boyunca AuNP'lere bağlanmasına izin verin.
   2. Partiküllere karşı 200:1'lik bir antikor oranı oluşturmak için PEGile antikoru (PEG-Ab) AuNP ve Raman raportör çözeltisinin bir partisine ekleyin. Bu çözüm test numuneleri için olacaktır. Ayrı bir mikrosantrifüj tüpünde, PEGile antijeni, kontrol olarak kullanılacak partiküllere 200: 1 oranında AuNP ve Raman raportör çözeltisinin diğer partisine ekleyin. Çözeltileri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Antikorların partiküllere oranı, kullanılan AuNP'lere ve boyaya özgü olacaktır ve her bir durum için optimize edilmelidir. Buradaki amaç, partiküllerin toplanmasını önlerken AuNP problarının bağlanması için en yüksek antikor oranına sahip olmaktır. Toplanacak uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın:
      
      burada V hacimdir ve C, ml başına partiküller veya antikorlar olarak ifade edilen konsantrasyondur. Son hacim yaklaşık 1.5 ml olmalıdır.
4. AuNP yüzeyinde kalan bölgeleri mPEG-SH ile engelleyin.
   1. Katı metoksi polietilen glikol tiyolu su kullanarak 200 μM konsantrasyona çözerek mPEG-SH'yi hazırlayın. mPEG-SH tamamen çözülene kadar çözeltiyi girdaplayın.
   2. Adım 2.3'te yapılan AuNP-PEG-Ab çözümüne 40.000:1 oranında mPEG-SH ekleyin. Altın nanopartikül üzerinde kalan bölgelerin bloke edildiğinden emin olmak için çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Toplanacak uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın:
      
      burada V hacimdir ve C, ml başına partiküller veya antikorlar olarak ifade edilen konsantrasyondur. Son hacim yaklaşık 1.5 ml olmalıdır.
5. İşlevselleştirilmiş Raman araştırmalarını kurtarın.
   1. Parçacıkları 5.000 x g'da 20 dakika boyunca düşük bağlamalı santrifüj tüplerinde veya süpernatan berraklaşana kadar santrifüjleyin. AuNP'leri rahatsız etmemeye dikkat ederek pipetleme yaparak süpernatanı çıkarın.
   2. Partikülleri daha önce yapılmış olan 1 ml 1x PBS çözeltisi ile tekrar süspanse edin. Küçük hacimli bir çözeltinin (3 μl) UV-Vis ölçümünü alarak AuNP konsantrasyonunu tahmin edin ve sonuçları bilinen bir AuNP konsantrasyonundan elde edilen ölçümlerle karşılaştırın. Hacmi, nihai çözelti ml başına en az 1 x 10¹¹ parçacık olacak şekilde ayarlayın.
   3. İmmünoassay plakasını işlevsel hale getirmek için kullanılana kadar çözeltileri 4 ° C'de saklayın. Çözümleri bir hafta içinde kullanın.

Tablo 1. DTTC seyreltme örneği. DTTC'nin çeşitli dilüsyonları ve ilgili stok hacimleri DTTC, altın nanopartikül çözeltisi ve su.

)

	Her bileşenden eklenecek hacim (ml)
DTTC nihai konsantrasyonu (mM)	DTTC çalışma çözümü (200 mM)	AuNP (İngilizce	Su
0,2	0,1	20	79,9
0,6	0,3	20	79,7
1	0,5	20	79,5
2	1,0	20	79
5	2,5	20	77,5
7	3.5	20	76,5
10	5,0	20	75

2. İmmünoassay Plakası Hazırlama

1. İstenilen antijeni immünoassay plakasına bağlayın.
   1. Polistiren kuyularını doldurmak için yeterince seyreltilmiş antijen (50 μg / ml) hazırlayın. Çözeltiyi girdaplayın ve çözeltiyi hemen plaka kuyucuklarına ekleyin. Antijenin oda sıcaklığında 1 saat boyunca plakalara bağlanmasına izin verin.
2. Bağlanmamış antijenleri yıkayın.
   1. Çözeltiyi bir atık kabına boşaltarak ve plakayı kağıt havlu kaplı bir masaya vurarak fazla antijen çözeltisini çıkarın.
   2. Yüzeyi yıkamak için kuyucuklara TBST ekleyin, ardından yıkamayı daha önce belirtildiği gibi çıkarın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
3. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için plaka üzerinde kalan bağlanma yerlerini bloke edin.
   1. Plakanın her bir oyuğuna 70 μl HSA bloke edici çözelti ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
   2. Adım 3.2'de belirtilen prosedürün aynısını kullanarak plakayı çıkarın ve durulayın. Plakayı örtün ve daha fazla kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de kuru olarak saklayın.
4. İmmünoassay plakasını işlevselleştirin.
   1. Bölüm 2'de hazırlanan prob nanopartiküllerinden 70 μl'yi 96 oyuklu bir plakanın ilk sütununa ekleyin ve sonraki sütunları 1: 2 seri seyreltme kullanarak seyreltin. Plakanın en az 1 saat inkübe etmesine izin verin. İmmünoassay plakasının nasıl hazırlanacağına dair bir örnek Şekil 1'de verilmiştir.
   2. Plakayı TBST ile adım 3.2'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi beş kez yıkayın ve AuNP'leri uygun şekilde attığınızdan emin olun. Son yıkamadan sonra, her bir kuyucuğa 70 μl 1x PBS ekleyin ve bir plaka contası ile örtün.
      NOT: Kontrol numuneleri açık olmalıdır. Spesifik olmayan bağlanma meydana gelmişse, kontrol numuneleri, test numuneleri ile benzer bir renge sahip olacaktır.
5. UV-Vis ve Raman spektroskopisi ile test testi hassasiyeti.
   1. Her kuyucuk için, plaka okumalı bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak 400 ila 700 nm arasında değişen UV-Vis spektrumlarını ölçün.
   2. Ters çevrilmiş bir Raman mikroskobu kullanarak, hedefi AuNP problarının bulunduğu kuyunun yüzeyine odaklayın. Kuyunun Raman spektrumlarını elde edin. 1.800 ^cm-1 ila 400 ^cm-1 arasında değişen bir spektrum toplayın. Tüm kuyucuklar için bu adımı tekrarlayın.
   3. Uygun spektral yazılımı kullanarak, Raman spektrumları için 11. dereceden bir polinom taban çizgisi düzeltmesi ve UV-Vis spektrumları için 3. dereceden bir polinom gerçekleştirin.
   4. Uygun spektral yazılımı kullanarak Raman ve UV-Vis spektrumlarını normalleştirin. Maksimum değeri 1 olarak ayarlayın ve diğer tüm değerleri buna göre ölçeklendirin. Raman spektrumlarını normalleştirmek için benzersiz bir polistiren tepe noktası seçin ve bunu 1'e eşit olarak ayarlayın ve diğer tüm değerleri buna göre ölçeklendirin.
   5. Uygun spektral yazılımı kullanarak, her spektrum için tepe entegrasyonu gerçekleştirin. Raman spektrumları için, Raman muhabirini temsil eden tepe noktası, polistiren tepe noktalarının olmadığı bir bölgede olmalıdır. Tepe entegrasyonunu gerçekleştirmek için, istenen tepe noktası için integral sınırlarını belirtin ve kontroller dahil tüm örnekler için istenen tepe alanını kaydedin.
   6. Ortalama tepe ilgi alanını, AuNP konsantrasyonunun günlüğünün bir fonksiyonu olarak, her nokta için ilişkili standart sapmayı gösteren hata çubukları ile çizin. Bu kalibrasyon noktalarını 4 parametreli bir lojistik eğrisine sığdırın.
   7. Boş bir örnek için ilgilenilen tepe noktasının alanının ortalamasını alarak boşluğun ortalama değerini belirleyin. Bu alanların standart sapmasını belirleyin; Bu, boşluğun standart sapmasıdır.
   8. Önceki adımda analiz edilen aynı tepe için, en düşük konsantrasyon için o tepe alanının standart sapmasını bulun.
   9. Temsilci sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi boş ve alt algılama sınırını hesaplayın. AuNP konsantrasyonu açısından LLOD'yi belirlemek için bu değerleri 4PL kalibrasyon eğrileriyle birlikte kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1. Hazırlanan immünoassay plakası. Hazırlanmış bir immünoassay plakasının görüntüsü. A'dan E'ye kadar olan sıralar test numuneleri, F'den H'ye kadar olan sıralar ise kontrol numuneleridir. Sütun 1, seyreltilmemiş nanopartikülleri içerir ve sonraki her kolon, AuNP problarının yarısı konsantrasyonuna sahiptir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
60 nm Altın Nanoparçacık	Ted Pella, Inc.	15708-6	Bunlar sitrat kapaklı altın nanopartiküllerdir. Raman muhabiri ile AuNP yüzey yükü arasındaki ilişki ve bunun AuNP ve/veya Raman muhabirinin doğru seçimine etkisi için lütfen Tartışmaya bakın.
Sodyum Bikarbonat	Balıkçı Bilimsel	S233-500 Serisi
metanol	Pharmco-Aaper	339000000
Tris Tamponlu Tuzlu Su (10x) pH 7.5	Scy Tek	TBD999
Şişe Üstü Filtrasyon Ünitesi	VWR (VWR)	97066-202
Tween 20 (polisorbat 20)	Scy Tek	TWN500 Serisi	Yıkama aşamaları için emülsifiye edici bir ajan olarak kullanılır.
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su 10x Konsantresi, pH 7.4	Scy Tek	PBD999
Protein LoBind Tüpü 2.0 ml	Eppendorf Tüpleri	22431102	LoBind tüpleri, proteinlerin ve AuNP'lerin tüplerin yüzeylerine bağlanmasını önler.
Protein Bağlama Tüpü 0.5 ml	Eppendorf Tüpleri	22431064	LoBind tüpleri, proteinlerin ve AuNP'lerin tüplerin yüzeylerine bağlanmasını önler.
Mikroplaka Cihazları UniSeal	GE Sağlık	7704-0001	İşlevselleştirilmiş plakaların sızdırmazlığı ve saklanması için kullanılır.
Test plakası, düşük buharlaşma kapaklı, 96 kuyulu düz tabanlı	Yardımcı yıldız	3370
HPLC sınıfı su	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3" -Dietiltiatrikarbosiyanin iyodür (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Raman muhabiri
mPEG-Tiyol, MW 5.000 - 1 gram	Laysan Biyo A.Ş.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1 gram	Laysan Biyo A.Ş.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA'nın bir NHS sonu vardır.
Fare IgG, Tüm Molekül Kontrolü	Thermo Fisher Bilimsel	31903	Antijen
Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor	Thermo Fisher Bilimsel	31164	antikor
İnsan Serumu Albümin Bloke Edici Çözelti	Sigma Aldrich	A1887-1G	Bunun yerine sığır serum albümini kullanılabilir.
UV-Vis Spektrofotometre	Termo Bilimsel	Nano damla 2000c
UV-Vis Spektrofotometre	BioTek	Sinerji 2
Şirket içi 785 nm ters Raman mikroskop ünitesi	Yok	Yok	Ters çevrilmiş bir Raman mikroskobu, kuyu plakasının yüzeyine düzgün bir şekilde odaklanmak için en iyisidir. Aksi takdirde, 96 oyuklu plakanın yüksekliği nedeniyle çok düşük bir büyütme kullanılacaktır. Bir satıcıdan satın almaktan daha ucuz olduğu için şirket içi inşa edilmiş bir sistem kullanıldı. Bununla birlikte, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir ters Raman mikroskop sistemi kullanılabilir.