Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Farelerin intra-sisternal enjeksiyonu
NOT: Tüm prosedür, aseptik koşulları korumak için laminer akış kabininde gerçekleştirilir.
- Belirli patojen içermeyen koşullar altında ev laboratuvarı fareleri (8 haftalık, dişi Balb / c). Yiyecek peletleri ve su ad libitum sağlayın.
- Deneye başlamadan önce hayvanları 1 hafta boyunca yeni ortama oturtun.
- Deneye başlamadan önce vücut sıcaklıklarını tartın ve değerlendirin.
not: Sekiz haftalık akraba Balb/c dişi fareleri ortalama 19 g ağırlığındadır. Laboratuvar farelerinin ortalama sıcaklığı fizyolojik olarak 36-38 °C arasında değişmektedir.
- Hayvanı boynundan tırnağın, karın bölgesini %70 etanol ile temizleyin ve enfeksiyondan yaklaşık 2-3 saat önce 25 G'lık bir iğne 0.5 mm x 16 mm kullanarak murin karnının sağ alt kadranına i.p. demir dekstran (% 1 fosfat salin tamponunda çözülmüş, 250 mg / kg) enjekte edin.
not: İntraperitoneal enjeksiyon, idrar kesesi, çekum gibi karın içi organlara zarar vermemek için murin karnının sağ alt kadranına yapıldı. Enfeksiyondan önce hayvanlara demir dekstran şeklinde eksojen bir demir kaynağının uygulanması, konakçıda bakteri çoğalmasını kolaylaştırır.
- 2-3 saat sonra ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (3 mg / kg) ve oftalmik kayganlaştırıcı ile hayvan anestezisi yapın.
- Ayak parmağını sıkıştırırken ağrı tepkisi olmamasını sağlayarak anestezi derinliğini kontrol edin.
- Fareyi sternal dekübitusa yerleştirin ve vertebral sütunu düz bir pozisyonda tutmak için uzuvları ve servikal omurgayı dikkatlice gerin.
- 30 G iğne x 8 mm'lik bir şırınga yüklemeden önce tutarlı bir süspansiyon sağlamak için bakteriyel süspansiyonu nazikçe karıştırın.
not: Bakteriyel süspansiyonu enjeksiyon zamanına mümkün olduğunca yakın hazırlayın; Bu arada oda sıcaklığında saklayın.
- Çözülme sonrası bakteri titresine (CFU/mL) dayanarak, enfekte olacak toplam hayvan sayısına (hayvan sayısı başına CFU bakteri dozu) göre kullanılacak toplam CFU'nun hesaplanmasına devam edin. Çözülme sonrası bakteri titresi (CFU/mL) ile n farenin enfeksiyonu için yararlı olan toplam CFU arasında bir oran uygulayarak toplam CFU'yu elde etmek için flakondan alınacak tam hacmin hesaplanmasına devam edin (çözülme sonrası bakteriyel titre CFU: ml = toplam CFU: x). Enfekte olacak toplam hayvan sayısına göre nihai hacmi oluşturun.
not: Bu deneylerde, hayvan başına 104 ila 109 arasında geniş bir titre aralığı kullanılmıştır.
- Ameliyat bölgesini %70 etanol ile temizleyin.
- Enjeksiyon noktasını bir iğne yardımıyla tanımlayın ve meningokokların yerleşik CFU'sunu (vahşi tip suş ve izojenik mutant suş) veya kontrol olarak demir dekstran (5 mg / kg) ile takviye edilmiş GC suyunu, toplam 10 μL hacimde, 30 G iğne x 8 mm'lik bir oksipital çapak deliği kullanarak farelerin cisterna magna'sına enjekte edin.
- İğneyi kraniyoservikal bileşkeye, özellikle dorsal subaraknoid boşluğa yerleştirerek sternal inokülumu gerçekleştirin. Bu alanı erişilebilir kılmak için kafayı ventro flex yapın.
- Kısaca, hayvanı yanal yaslanmaya yerleştirin, kulakları yoldan uzak tutun ve boynu orta derecede (90 ila 100°) esnetin. Boynun orta hattının ve başın (burundan oksiputa kadar) masa üstüne mükemmel bir şekilde paralel konumda olduğundan emin olun.
- Atlas kanatlarına dokunun ve eksenel dönüşü ortadan kaldırarak üst üste bindiklerinden emin olun. Doğal bir girinti genellikle iğnenin oksipital deliğe girme olasılığının en yüksek olduğu orta hatta dokunulabilir.
- Neisseria ile farelerin enjeksiyonundan sonra şırıngayı ve iğneyi güvenli bir şekilde atın.
- Hayvanı kafese yerleştirin ve uyanmayı ve hareketin tamamen iyileşmesini bekleyin.
- Enfekte farelerin bulunduğu kafesleri laminer akış kabini altında tutun.
- Enfeksiyondan 24 saat sonra fareleri koma ölçeğine göre klinik koma belirtileri açısından izleyin. Koma ölçeği: 1 = koma, 2 = sırt üstü çevrildikten sonra dik durmaz, 3 = 30 saniye içinde dik durur, 4 = 5 saniye içinde dik durur, minimal ambulatuar aktiviteler, 5 = normal.
not: Hayvanlarda ağrı kaydedildiğinde, meloksikam ile analjezi (çalışma süresince 5 mg / kg ip) uygulandı.
2. Hayvan Sağkalımı ve CFU Sayıları
- Hayvanların Hayatta Kalması
- Hayvanları i.cist yolu ile enfekte etmek için farklı dozlarda (fare başına 10,4 ila 109 CFU arasında değişen) bakteri aşısı hazırlayın.
- Kontrol farelerini aynı şekilde demir dekstran (5 mg / kg) ile takviye edilmiş GC suyu ile aşılayın.
- Hayvanları klinik semptomlar açısından izleyin: deney süresince günde en az iki kez 168 saat (7 gün) boyunca tüm deney boyunca her gün fırfırlı kürk, kambur görünüm, hipotermi, kilo kaybı, uyuşukluk veya can çekişiyor.
- Her gün sırasıyla dijital terazi ve rektal termometre kullanarak vücut ağırlığını ve sıcaklığını ölçün.
- Farelerin bir hafta boyunca hayatta kalma oranını kaydedin.
not: Enfeksiyon sonrası hayvanın doğal ölümünü kaydederken, koma değeri 2'ye ulaşan veya 168 saatten fazla gözlem altında kalan hayvanlara ötenazi uygulanacaktır.
- Koma değeri 2 olan veya gözlem süresi boyunca hayatta kalan fareleri ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (3 mg / kg) ile uyuşturun ve oftalmik merhem uygulayın.
- Ağrı tepkisinin bir ayak parmağı sıkışması ile olmadığını kontrol edin.
- Servikal çıkık ile farelerin ötenazisini gerçekleştirin ve istatistiksel analiz için ölü olarak kaydedin.
- Enfekte hayvanlarda hayvan sağkalımı veya CFU sayım testi için devam edin.