Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Fare Kaynağı ve Muhafazası
- C57BL / 6J genetik arka plan üzerinde LysM-eGFP fareleri türetin. LysM-EGFP farelerini MyD88-/- farelerle C57BL / 6J arka plan üzerinde geçerek LysM-EGFP×MyD68-/- fareleri türetin.
- Bir vivaryumda ev fareleri. Bu çalışmalar için, hayvanlar ameliyattan önce gruplar halinde Davis, Kaliforniya Üniversitesi'nde barındırıldı ve ameliyattan sonra tek başına barındırıldı. 10-16 haftalık yaşlar arasında fareler kullanın.
2. Bakteri Hazırlama ve Miktar Tayini
- İlgilenilen biyolüminesan S. aureus türünü -80 ° C'lik depolamadan buz üzerinde çözdürmek için çıkarın. % 5 sığır kanlı agar plakasına sürün. Çizgili plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca (16 saat) 37 °C'de inkübe edin.
not: Bu protokolde ALC2906 SH1000 suşu kullanılmıştır. Bu suş, Photohabdus luminescens'ten luxABCDE raportör kasetine kaynaşmış penisilin bağlayıcı protein 2 promotörü ile mekik plazmidi pSK236'yı içerir.
- mL saf su başına 0.03 g TSB tozu karıştırarak triptik soya suyu (TSB) hazırlayın ve sterilize etmek için TSB'yi otoklavlayın. Soğuduğunda, steril bir teknik kullanarak gerekli antibiyotikleri ekleyin. Bu protokolde, biyolüminesans luxABCDE kasetini içeren pSK236 mekik plazmidinin ekspresyonunu seçmek için TSB'ye 10 μg/mL kloramfenikol ekleyin.
- Bir gece boyunca kültüre başlamak için S. aureus plakasından 3-4 ayrı koloniyi 10 μg / mL kloramfenikol ile TSB'ye alın. Bakterileri gece boyunca (16 saat) 37 ° C'de inkübe eden bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- Bir numuneyi 1:50 oranında 10 μg/mL kloramfenikol ile TSB'ye seyrelterek gece boyunca kültürden yeni bir bakteri kültürü başlatın. 200 rpm ve 37 °C'de inkübe edici bir çalkalayıcıda kültür.
- S. aureus'u böldükten iki saat sonra, bir spektrofotometrede 600 nm'de (OD600) optik yoğunluğu izleyin. Orta logaritmik faz büyümesini bulmak için OD600'ü zamana karşı gözlemleyin. ALC2906 SH1000 suşu için, 0.5'lik bir OD600 orta logaritmiktir ve 1 x 108 CFU/mL'lik bir konsantrasyona karşılık gelir (Şekil 1).
- OD600 0.5 olduğunda, bakterileri buz gibi soğuk DPBS ile 1: 1 oranında yıkayın. Bakterileri 3.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve ek soğutulmuş DPBS ekleyin ve iyice girdap yapın. 3.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika daha santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice boşaltın. Bakteri peletini istenen konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Bu çalışmalar için, 3 mL ALC2906 SH1000 toplayın ve yaklaşık 2 x 108 CFU / mL'lik bir bakteri konsantrasyonuna karşılık gelen 1.5 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Bakterileri kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Bakteri konsantrasyonunu doğrulamak için, bakteri örneğinin 100 μL'sini PBS'de 1:10.000 ve 1:100.000 oranında seyreltin. Bir agar plakası üzerinde 20 μL alikot plakası. 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 16 saat inkübe edin. Brüt muayene ile CFU'ları sayın ve ertesi gün bir bakteri konsantrasyonu hesaplayın.
3. Eksizyonel Deri Yarası ve S. aureus ile Aşılama
- İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla her fareye 100 μL 0.03 mg / mL buprenorfin hidroklorür (~ 0.2 mg / kg) uygulayın.
- Enjeksiyondan yirmi dakika sonra,% 2-4 izofluran içeren 2-3 LPM oksijen içeren bir odaya 2-4 fareyi yerleştirin. Fareler tamamen anestezi altına alındıktan sonra, fareleri birer birer% 2-4 izofluran ile 2-3 LPM oksijene bağlı bir burun konisine aktarın. Her bir arka pençeyi başparmak ve işaret parmağı arasında sıkıca sıkıştırarak farelerin tamamen uyuşturulduğunu doğrulayın. Hayvan çimdiklemeye cevap vermezse bir sonraki adıma geçin.
- Farenin arkasındaki 1 inç'e 2 inçlik bir bölümü elektrikli kesme makineleriyle tıraş edin ve temiz bir mendil veya gazlı bez kullanarak kürk kırpıntılarını temizleyin. Tüy dökücü losyon kullanmaktan kaçının çünkü aşırı iltihaplanmaya neden olabilir.
- Farenin arkasını önce %10 povidon-iyot ile ıslatılmış gazlı bez ve ardından %70 etanol ile ıslatılmış gazlı bez ile temizleyin. Alanı, cerrahi alanın merkezinden dışa doğru hareket ederek spiral bir düzende temizleyin. Ameliyattan önce cerrahi bölgenin kuruması için yaklaşık 1 dakika bekleyin.
- Farenin traşlı sırtını iki parmağınız arasında gevşek bir şekilde tutun ve hazırlanan cerrahi alanın ortasına 6 mm'lik steril bir punch biyopsisine sıkıca bastırın. Cildi gergin bir şekilde çekmeyin.
- Zımba biyopsisini, cilt üzerinde, taslağın en az bir bölümünde cildi tamamen kesen dairesel bir taslak oluşturmak için bükün. Alttaki fasyayı veya dokuyu kesmemeye dikkat edin.
- Punch biyopsisi tarafından basılan dairesel deseni takip ederek epidermis ve dermisi kesmek için steril makas ve forseps kullanın.
4. S. aureus Aşılama
- 28 G'lik bir insülin şırıngasını istenen biyolüminesan bakteri aşılayıcı ile doldurun. Bu çalışmada, 1 x 108 CFU / mL (50 μL) konsantrasyon uygulayın. 100 μL'den fazla hacim uygulamayın.
- Farenin arkasındaki yaranın ortasındaki fasya ile doku arasına 50 μL aşılayıcı enjekte edin. Aşılayıcının, minimum sızıntı veya dağılma ile yaranın merkezinde bir kabarcık oluşturduğundan emin olun.
- Dermisi yana doğru çekin, şırıngayı dokuya neredeyse paralel tutun ve şırıngayı, fasyanın delindiğini gösteren dirençte ani bir azalma hissedilene kadar yavaşça dokuya itin. Şırıngayı dikkatlice yaranın ortasına yönlendirin ve aşılayıcıyı yavaşça dağıtın. Şırıngayı hayvandan yavaşça çıkarın.
- Yukarıda tarif edildiği gibi enfekte olmamış hayvanların yaralarına aynı hacimde steril PBS enjekte edin.
- Hayvanı kafesine geri koyun. Kafesi bir ısı lambasının altına veya bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve anesteziden iyileşene kadar hayvanı izleyin.
5. In vivo BLI ve FLI
- Cihaz yazılımı aracılığıyla tüm hayvan görüntüleyiciyi başlatın. % 2-4 izofluran ile 2-3 LPM oksijen alan bir odada fareleri uyuşturun. Görüntüleyicinin içindeki burun konilerine anestezi verin.
- Yaralı ve enfekte olmuş fareyi görüntüleyiciye yerleştirin. Fareyi, yara mümkün olduğunca düz olacak şekilde konumlandırın. Fareleri görüntülemek için aşağıdaki sıra kurulumunu kullanın.
- Görüntüleme modu olarak Lüminesans ve Fotoğraf'ı seçin. Pozlama süresi küçük gruplamada 1 dakikadır ve F/stop 1 (lüminesans) ve F/stop 8'dir (fotoğraf). Emisyon filtresi açık. Görüntüyü kaydetmek için Elde Et düğmesine tıklayın.
- Görüntüleme modu olarak Floresan ve Fotoğraf'ı seçin. Pozlama süresi, küçük gruplamada 1 s ve 465/30 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve yüksek lamba yoğunluğuna sahip 520/20 nm'lik bir emisyon dalga boyuna sahip F/stop 1 (Floresan) ve F/stop 8'dir (fotoğraf). Görüntüyü kaydetmek için Elde Et düğmesine tıklayın.
- Hayvanı kafesine geri koyun ve anesteziden iyileşene kadar izleyin.
- Yukarıda açıklandığı gibi günlük olarak fareleri görüntüleyin.
>6. Görüntü Analizi
- Ölçülecek görüntüleri açın.
- Görüntüdeki her fare için çevreleyen cilt de dahil olmak üzere tüm yara alanına büyük bir dairesel ilgi alanı (ROI) yerleştirin. Nötrofil in vivo FLI EGFP sinyalleri ve in vivo BLI S. aureus sinyalleri birkaç gün sonra yara kenarının ötesine uzanır ve bu çalışmalara dahil edilmiştir (Şekil 2A ve 2B). ROI'yi Ölç'e tıklayın ve her fare için ortalama akı değerlerini kaydedin. Her sinyalin zamana karşı ortalama akısını (p/s) çizin.
- Yaradaki mutlak nötrofil veya S. aureus sayısı isteniyorsa, aşağıdaki deneyleri yapın.
- Nötrofil sayılarını in vivo FLI EGFP sinyalleriyle ilişkilendirmek için, yukarıda tarif edildiği gibi C57BL / 6J fareleri yaralayın ve LysM-EGFP veya LysM-EGFPxMyD88-/- donörlerinden bir dizi kemik iliği türevi nötrofil (5 x 105 ila 1 x 107) aktarın. Yukarıda açıklandığı gibi görüntü ve in vivo FLI EGFP sinyallerini bilinen nötrofil miktarıyla ilişkilendirin.
- S. aureus CFU'yu in vivo BLI sinyalleriyle ilişkilendirmek için, fareleri yukarıda tarif edildiği gibi yaralayın ve enfekte edin. Enfeksiyon sonrası 1. günde, farelerden gelen in vivo BLI sinyallerini kaydedin ve hemen ötenazi yapın ve karkasları soğutun. Yarayı eksize edin, dokuyu homojenize edin ve gece boyunca inkübasyon için agar üzerinde bakteri seyreltmelerini plakalayın. Ertesi gün, yara başına CFU'yu belirlemek için kolonileri sayın.
- Yara iyileşmesini ölçmek için, yara kenarına dairesel bir ROI yerleştirin ve yaranın alanını (cm2) ölçün ve taban çizgisinden zamana göre fraksiyonel değişimi çizin (Şekil 2C).
